材料和试剂

从患者血清样品中提取HBV DNA
1. 1.5ml微量离心管（Axygen，目录号：17615044）
2. 患者血清样品
3. 三苯酚（北京双祥达公司，目录号：108952）
4. 三氯甲烷（Sinopharm Chemical Reagent Co.，目录号：61553）
5. 乙醇（Sinopharm Chemical Reagent Co.，目录号：32061）
6. 异丙醇（Sinopharm Chemical Reagent Co.，目录号：32064）
7. 酵母RNA（Life Technologies，Ambion ，目录号：AM7118）
  注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Ambion ^TM ，目录号：AM7118" />
8. 醋酸钠三水合物（NaOAc）（Sigma-Aldrich，目录号：236500）
9. 乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：EDS）
10. 十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：L3771）
11. Tris-base（Sigma-Aldrich，目录号：T1378）
12. 病毒裂解缓冲液（见配方）

通过聚合酶链反应（PCR）扩增HBV DNA

KOD-PLUS：高保真DNA聚合酶（TOYOBO CO。，目录号：KOD201）

用于如下所述的PCR的引物（详细描述可参考图1）

名称	输入	序列5'-3'	5'-碱基的位置
P1	前进	CCGGC G TCGACGAGCTC TTTTCACCTCTGCCTAATCA	1821
P2	前进	CCGGC GTCGACGAGCT C AAAAGTTGCATGGTGCTGG	1825
P3	反向	CACTGAACAAATGGC ACTAGT AAACTGAGCC	699
P4	反向	GGCTCAGTTT ACTAGT GCCATT TGTTCAGTG	669

注意：带下划线的红色字母是限制性内切酶结合位点。 P1：Sal I，Sac I; P2：Sal I，Sac I; P3：Spe I; P4：Spe I. P1/P3用于扩增2.05kb片段（1,821-699bp），P2/P4 ?用于扩增1.15kb片段（669-1,825bp）。

HBV DNA的凝胶提取
1. （Thermo Fisher Scientific，Axygen ^TM，目录号：APGX50）
添加dATP以产生3'突出端
1. Taq DNA聚合酶（TOYOBO CO。，目录号：TAP201）
2. dATP（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ，目录号：R0141）
将HBV DNA整合到pGEM ^? -T载体
中
1. pGEM -T载体系统I（Promega公司，目录号：A3600）
2. 0.5ml微量离心管（Axygen，目录号：05615119）
转换
1. 感受态DH5α（Takara，目录号：9057）
2. 氨苄西林（Sinopharm Chemical Reagent Co.，目录号：69523）
3. 异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）（Sigma-Aldrich，目录号：PHG0010-5G）
4. 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷（X-gal）（Sigma-Aldrich，目录号：B4252-50MG）
5. 氯化钠（NaCl）（Sinopharm Chemical Reagent CO。，目录号：10019318）
6. TRYPTONE（Oxoid Limited，目录号：LP0042）
7. YEAST EXTRACT（Oxoid Limited，目录号：LP0021）
8. LB培养基（参见配方）
从大肠杆菌-DH5α提取HBV DNA整合的质粒
1. 质粒DNA小试剂盒I（Omega Bio-tek Inc.，目录号：D6942-02）
全长HBV基因组整合到克隆载体pUC19
中
1. I（New England Biolabs，目录号：R0156S）
2. I（New England Biolabs，目录号：R0138S）
3. I（New England Biolabs，目录号：R0133S）
4. T4 DNA连接酶（New England Biolabs，目录号：M0202S）

设备

PCR仪（Biocompare，Biometra，目录号：070851）
离心机（Eppendorf，型号：5424）
电泳系统（北京柳一生物技术有限公司，型号：DYY6C）
电子秤（Mettler-Toledo International Inc.，型号：PB602-N）
注意：目前，它是"Mettler-Toledo International Inc.，型号：PB602-S"。
细菌培养箱（生物装置，上海京红实验室仪器有限公司，型号：GNP-9080）
BIO IMAGING SYSTEM（Syngene，型号：SYDR2/1361）
热块

程序

从患者血清样品中提取HBV DNA
1. 向100μl血清样品中加入100μl病毒裂解缓冲液，在65℃孵育4小时
2. 剧烈加入125μlTris苯酚和125μl三氯甲烷涡旋10秒。然后，在室温下以13,000rpm离心5分钟温度。该步骤可以将蛋白质与核酸分离核酸会在水层中。
3. 将上层水溶液转移到新的1.5 ml管中。
4. 加入20μg酵母RNA（此处作为共沉淀剂），0.1体积NaOAc和 ?0.7体积异丙醇。反转几次后，将混合物在-20℃下沉淀过夜
5. 在4℃下以13,000rpm离心15分钟，弃去上清液
6. 加入1ml 70％乙醇，轻轻倒转
7. 在4℃下以13,000rpm离心5分钟，弃去上清液
8. 干燥DNA沉淀5?10分钟（空气干燥），并溶解在20μlddH 2 O中作为PCR模板。

通过聚合酶链反应（PCR）扩增HBV DNA

PCR系统：

试剂	体积/μl
10x KOD缓冲区	5微升
dNTP（各2.5mM）	5微升
P1（20mM）	1微升
P3（20mM）	1微升
模板	5微升
Mg 2+（25mM）	2微升
KOD_PLUS酶（1U /μl）	1微升

加入ddH 2 O至最终体积为50μl。

PCR反应程序：
94℃，5分钟
94℃，30秒
55℃，30秒40个循环
68℃，2分钟
68℃，10分钟
对于1.15kb片段扩增，使用P2和P4引物 PCR反应程序的延伸进程应改变 68℃，2分钟至68℃，1分钟
每个加入10x DNA加载缓冲液样品并通过移液混合。通过在a上运行来纯化PCR产物 1％琼脂糖凝胶，100V，30分钟注意：这里使用的凝胶尺寸为6厘米;电压/运行时间会随所使用的凝胶装置而变化。

HBV DNA的凝胶提取
1. 切除含有感兴趣的DNA片段的琼脂糖凝胶切片与一个干净，锋利的手术刀在紫外线照明下。简要地说将切下的凝胶切片放在吸收性毛巾上以除去残余物缓冲。将凝胶切片转移到一块或塑料包装或称重船。将凝胶切成小块并称重。在本应用中，凝胶的重量被认为等于体积。例如， 100mg凝胶相当于100μl体积。转移凝胶切片进入1.5ml微量离心管中注意：或者，凝胶切片可以 ?置于1.5ml微量离心管中，然后用α粉碎移液管尖端或其他合适的装置。旋管30秒，在12000 ?x g以凝固在管底部的凝胶。使用以评估琼脂糖凝胶的体积。
2. 添加3x样品体积的缓冲液DE-A 注意：Buffer DE-A的颜色是红色。这种颜色用于添加对比在下一步，使任何片段的未溶解的琼脂糖可以显示。
3. 通过涡旋将凝胶重悬在缓冲液DE-A中。 ?在75℃加热直至凝胶完全溶解（通常为6-8℃） min）。如果使用低熔点琼脂糖凝胶，在40℃加热。间歇涡旋（每2-3分钟）将加速凝胶溶解重要信息：凝胶必须完全溶解或DNA片段恢复将减少。
  重要：请勿加热凝胶超过10分钟。
4. 加入0.5x缓冲液DE-A体积的缓冲液DE-B，混合。如果DNA片段 ?小于400bp，进一步补充1×样品体积异丙醇示例：对于相当于100μl的1％凝胶切片，添加以下内容：
  ?300μl缓冲液DE-A
  ?150μl缓冲液DE-B
  如果DNA片段<400 bp，您还需要添加：
  ?100μl异丙醇
  注意：添加后混合物的颜色将变为黄色缓冲液DE-B。请确保内容是均匀的黄色然后继续。
5. 将Miniprep柱放入2ml微量离心机中管（提供）。将溶解的琼脂糖从步骤C4转移到柱。以12,000 x g离心1分钟。
6. 弃去滤液从2ml微量离心管。将Miniprep柱返回到2 ml 微量离心管，加入500μl缓冲液W1。以12,000 xg离心机离心。 ?30秒。
7. 弃去2ml微量离心管中的滤液。将Miniprep柱返回到2ml微量离心管中，加入700μl 缓冲器W2。以12,000×g离心30秒。
  注意：请确保 ?95-100％乙醇已添加到缓冲液W2浓缩物中。做一个瓶标签上的符号，供将来参考。
8. 丢弃滤液从2ml微量离心管中。将Miniprep栏放回原处进入2ml微量离心管。添加第二个700μl等份的缓冲液W2 并以12,000×g离心1分钟注意：用Buffer洗涤两次 ?W2用于确保完全去除盐，消除在随后的酶反应，如连接中的潜在问题和测序反应。
9. 弃去2ml的滤液微量离心管。将Miniprep柱放回2ml微量离心机中管。以12,000 x g离心1分钟。
10. 转移Miniprep 柱置入干净的1.5ml微量离心管（提供）中。为了洗脱DNA，向膜的中心加入25-30μl的洗脱液或去离子水。 ?让它在室温下放置1分钟。以12,000 x g离心1分钟。
  注意：
  1. 在65℃下预热洗脱液通常会提高洗脱效率。
  2. 去离子水也可用于洗脱DNA片段。
  3. 更详细的信息可以参考此处的PDF协议文件。
添加dATP以产生3'突出端
1. 添加dATP的反应体系：
  
  试剂
  体积/μl
  
  dATP
  1微升
  
  10x Taq缓冲区
  1微升
  
  Taq
  1微升
  
  PCR产物
  7微升
2. 在72℃孵育30分钟。

将HBV DNA整合到pGEM ^? -T载体
中

短暂离心pGEM -T Vector管，收集管底部的内容物。

如下所述设置连接反应。涡旋2x快速每次使用前大力连接缓冲液。使用已知的0.5毫升管具有低DNA结合能力

试剂	卷
2X快速连接缓冲液	5微升
pGEM ^? -T Vector（50 ng）	1微升
PCR产物	2微升
T4 DNA连接酶（3Weiss单位/μl）	1微升
去离子水至最终体积为	10微升

通过吸移混合反应。在室温下孵育反应1小时温度。或者，将反应在4℃下孵育过夜 ?转化子的最大数目。

更详细的信息可以参考此处的PDF协议文件。

转换
1. 将5μl连接产物加入50μl感受态大肠杆菌-DH5α中，在冰上孵育30分钟。
2. 在42℃孵育90秒，然后立即在冰上转移3分钟
3. 加入1ml LB培养基，在37℃振荡器孵育1小时
4. 在室温下以8,000rpm离心2分钟并扔掉 ?上清液，用50μlLB培养基重悬细菌沉淀
5. 加入2μlIPTG（储存浓度：20％，m/V）和 20μlX-gal（储存浓度：2％，m/V），然后通过移液混合将溶液铺在Amp电阻板（终浓度Amp： ?50μg/ml）
6. 将板在37°C细菌培养箱中12-16小时
7. 选择白色克隆获得HBV DNA整合质粒。
从 .col i -DH5α提取HBV DNA整合质粒
1. 从板中分离白色单菌落（步骤F6），并接种a 培养含有Amp抗生素的5ml LB培养基。孵化为 ?12-16小时，在37℃伴随剧烈摇动（?300rpm）。使用10-20毫升培养管或具有体积至少4倍体积的烧瓶文化。
2. 在室温下以10,000×g离心1分钟。
3. 倾析或吸出并丢弃培养基。
4. 加入250μlSolution I/RNase A.涡旋或用移液器上下混合彻底。细胞沉淀的完全重悬对于获得是至关重要的良好的产量注意：使用前必须将RNase A添加到Solution I中。请参阅第6页上的准备试剂部分中的说明（附上此处）。
5. 将悬浮液转移到新的1.5 ml微量离心管中
6. 加入250μl溶液II。倒转并轻轻旋转几个管次以获得澄清的裂解物。可能需要2-3分钟的孵育注意：避免剧烈混合，因为这将剪切染色体DNA和降低质粒纯度。不要让裂解反应进行得更多超过5分钟。储存溶液II在不使用时密封，避免在空气中从CO
7. 加入350μl溶液III。立即倒置几次，直到形成絮状白色沉淀。
  注意：彻底和立即混合溶液是至关重要的 ?添加溶液III后避免局部沉淀。
8. 以最大速度（≥13,000×g/min）离心10分钟。将形成紧凑的白色沉淀。立即进行下一步。
9. 将HiBind ^? DNA Mini Column插入2ml收集管。
10. 通过仔细转移步骤G8的澄清的上清液将其吸入HiBind ^？ DNA Mini Column。小心不要干扰沉淀，没有细胞碎片转移到 HiBind ^? DNA Mini Column。
11. 以最大速度离心1分钟。
12. 弃去滤液并重新使用收集管。
13. 加入500μlHB缓冲液
14. 以最大速度离心1分钟。
15. 丢弃滤液和重复使用收集管。
16. 加入700μlDNA洗涤缓冲液注意：DNA洗涤缓冲液必须在使用前用100％乙醇稀释。请参阅第6页（附加此处）以获取说明。
17. 以最大速度离心1分钟。
18. 弃去滤液并重新使用收集管。
19. 将空的HiBind ^? DNA Mini Column离心2分钟，以最大速度干燥柱基。
  注意：干燥HiBind ^? DNA Mini Column矩阵很重要洗脱。残余乙醇可能会干扰下游应用。
20. 将HiBind ^? DNA Mini Column转移到干净的1.5 ml微量离心管中。
21. 加入30-100μl洗脱缓冲液或无菌去离子水直接到柱膜中心注意：从HiBind DNA Mini Column中洗脱DNA的效率是 ?取决于pH。如果使用无菌去离子水，确保 pH约为8.5。
22. 让在室温下放置1分钟。
23. 以最大速度离心1分钟。
  注意：这代表约70％的结合DNA。可选第二次洗脱将产生任何残留的DNA，虽然在较低集中。
24. 质粒测序，选择正确的HBV DNA整合质粒进行下面的步骤
  更详细的信息可以参考此处的PDF协议文件。

全长HBV基因组整合到克隆载体pUC19
中

用 I和 Spe I消化2.05kb-HBV DNA整合的质粒， 1.15-HBV DNA整合质粒与Sac I和Spe I I，具有Sal I和Sac I的pUC19质粒。详细的反应体系如下所述

试剂	2.05 kb-HBV DNA-integrated plasmid	1.15 kb-HBV DNA-整合的质粒	pUC19
10x摘要缓冲区	2微升	2微升	2微升
Sal I	1微升	-	1μl
我	1微升	1微升	-
I	-	1微升	1微升
质粒：	1微克	1微克	1微克
去离子水至最终体积为	20微升	20微升	20微升

在37℃孵育1小时
向每个样品加入10x DNA上样缓冲液，通过移液混合。凝胶通过在100V下在1％琼脂糖凝胶上电泳30分钟纯化产物
如步骤C中所述凝胶提取2.05kb片段，1.15kb片段和?2.7kb线性pUC19片段。

使用T4 DNA连接酶将它们在4℃下整合过夜。详细的反应体系如下所述

试剂	量
10x连接缓冲液	1微升
?2.7kb线性pUC19片段	1微升
2.05 kb片段	3微升
1.15 kb片段	4微升
T4 DNA连接酶	1微升
最终体积为	10微升

在4℃下将反应孵育过夜以获得最大数目的转化体。
按照步骤F1-6中所述将连接产物转化到感受态大肠杆菌-DH5α中。
按照步骤G从大肠杆菌 i -DH5α提取重组质粒。
使用 I和 I确定质粒。详细步骤可参考H1-3。
这三个片段的质粒：2.7kb，2.05kb和1.15kb 通过用Sac I和 Spe I（图2C）消化形成的是正确的全长HBV基因组整合质粒，pUC/HBV质粒。

代表数据

图1. HBV DNA克隆的示意图。从患者血清中提取HBV DNA作为PCR模板。引物P1和P3用于扩增2.05kb-HBV DNA片段;引物P2和P4用于扩增1.15kb-HBV DNA片段。将两个片段分别连接到pGEM -T载体中，并进行序列分析。从正确的重组质粒中消除了2.05kb-HBV DNA片段和1.15kb-HBV DNA片段，并连接到pUC19质粒中以形成重组pUC/HBV质粒。

图2. pUC/HBV的构建和鉴定 A. 1.15kb HBV DNA片段的扩增。泳道1：标记;泳道2,3：样品。 B.扩增2.05kb HBV DNA片段。泳道1：标记;泳道2,3：样品。 C.通过 Sac I和 Spe I消化鉴定pUC/HBV。泳道1：泳道2：阴性克隆;泳道3：阳性克隆。

食谱

病毒裂解缓冲液
20mM Tris-HCl（pH8.0） 10 mM EDTA
0.1％SDS
0.8mg/ml蛋白酶K
LB培养基
10g/L NaCl
10 g/L胰蛋白酶
5g/L酵母提取物

致谢

这个协议从以前的工作修改了许石和梁曹。本研究得到中国国家自然科学基金（31200699）的支持。

参考文献

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Gunther，S.，Li，B.C.，Miska，S.，Kruger，D.H.，Meisel，H。和Will，H。（1995）。有效扩增完整乙型肝炎病毒基因组的新方法允许快速功能分析并揭示缺失突变体免疫抑制的患者。病毒学 69（9）：5437-5444。
He，J.，He，L.and Yao，X。（1998）。研究乙型肝炎病毒全长基因组的新方法。 Chin J Infect Dis 16（2）：p70-72。
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Li，L.，Shen，H.，Li，A.，Zhang，Z.，Wang，B.，Wang，J.，Zheng，X.，Wu，J.，Yang，D.，Lu， Song，J。（2013）。在流体动力注射小鼠中抑制乙型肝炎病毒（HBV）基因表达和HBx基因沉默的复制模型与HBV基因型B的新克隆。病毒 10：214.