材料和试剂

取样管（1.5ml）（Ina-optika corporation，Ina Optica，目录号：CF-0150）
取样管（50ml）（Corning，Falcon ，目录号：352070）
玻璃小瓶（Shimadzu Scientific Instruments，目录号：GLC4010-17）
毛细管柱（15m，内径0.25mm）（Restek Corporation，型号：Rtx-1MS）
蓝藻（ Anabaena sp。PCC7120， Synechococcus elongatus PCC7942和
硝酸钠（NaNO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：28-3440-5）
注意：目前为"Sigma-Aldrich，目录号：28-3440"。
磷酸氢二钾（K 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：24-5240-5）
注意：目前为"Sigma-Aldrich，目录号：24-5240"。
硫酸镁七水合物（MgSO 4·7H 2 O·7H 2 O）（KANTO KAGAKU，目录号：25034-00）
氯化钙脱水物（CaCl 2·2H 2 O 2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：05-0590-5）
注意：目前，它是"Sigma-Aldrich，目录号：05-0590"。
柠檬酸（KATAYAMA CHEMICAL，目录号：05-4930）
注意：目前为"Sigma-Aldrich，目录号：05-4930"。
柠檬酸铁（Wako Pure Chemical Industries，Siyaku，目录号：097-00835）
无水乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA-Na 2）（Sigma-Aldrich，目录号：09-1420-5）
碳酸钠（Na 2 CO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：28-2180-5）
硼酸（H 3 BO 3）（KATAYAMA CHEMICAL，目录号：03-2900）
注意：目前，它是"Sigma-Aldrich，目录号：03-2900"。
氯化锰（II）（MnCl 2）（KANTO KAGAKU，目录号：25061-00）
硫酸锌七水合物（ZnSO 4·7H 2 O 7H 2 O）（KATAYAMA CHEMICAL，目录号：37-0550）
注意：目前，它是"Sigma-Aldrich，目录号：37-0550"。
将脱水钼酸钠（Na 2 MoO 4）2·2H 2 O）（KATAYAMA CHEMICAL，目录号：28- 3400）
注意：目前，它是"Sigma-Aldrich，目录号：28-3400"。
硫酸铜（II）五水合物（CuSO 4+，5H 2 O）（KATAYAMA CHEMICAL，目录号：05-6220）
注意：目前，它是"Sigma-Aldrich，目录号：05-6220"。
六水合硝酸钴（II）[Co（NO 3）2 sub] 6 6H 2 O]（KATAYAMA CHEMICAL，目录号：05-5230）
注意：目前，它是"Sigma-Aldrich，目录号：05-5230"。
氯化钠（NaCl）（KANTO KAGAKU，目录号：37144-00）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：24-4290-5）
氯化镁六水合物（MgCl 2·6H 2 O·6H 2 O）（KANTO KAGAKU，目录号：25009-00）
甲醇（KANTO KAGAKU，目录号：25183-70）
十五烷（TCI America，目录号：S0287）
十七烷（TCI America，目录号：S0289）
Anabaena sp。的BG-11培养基。 PCC7120和< em>细长聚球藻PCC7942（Stanier等人，1971）（参见Recipes）
（Hibino et al。，1999）的BG-11培养基+ Turk岛盐溶液（0.5M NaCl）（参见Recipes）

设备

玻璃锥形瓶（500ml尺寸）
振动器（TAITEC CORPORATION，型号：NR-3）
恒温室[温度通过调节器（Panasonic，目录号：MCU-201 CPH2）设置为30℃（±0.1℃）]
荧光灯（光质量：自然白，总光通量：2,950lm）（Yodobashi Camera Co.，TOSHIBA，型号：FL40SN）
光谱仪（Shimadzu Scientific Instruments，型号：UV-160A）
离心机（50ml管）（KUBOTA公司，目录号：5911）
离心机（用于1.5ml管）（KUBOTA Corporation，目录号：3700）
真空蒸发器（TAITEC CORPORATION，型号：Vc-15s）
超声波仪（TAITEC CORPORATION，型号：VP-5s）
冰箱
GC-MS（Shimadzu Scientific Instruments，目录号：GCMS-QP2010）
氦气

软件

GCMSsolution软件版本2.40（Shimadzu Scientific Instruments，目录号：225-13067-91）

程序

蓝细菌的生长
PCC7120和细长聚球藻PCC7942在玻璃锥形瓶中的液体BG-11培养基中在30℃下在恒定的白色荧光灯下以约40μE/m 2/s/s生长。恒温室。将培养物以105rpm摇动。在藻蚜藻的情况下，使用BG-11培养基加特克岛盐溶液（0.5M NaCl）代替BG-11培养基。通过用分光光度计测量730nm处的吸光度来监测蓝细菌细胞的生长注意：
1. 其他条件例如非生物胁迫条件（氮饥饿，高盐度等）（Kageyama et al。，2015）。
2. 在500ml大小的烧瓶中，培养物体积应小于200ml。
收获细胞
1. 指数地生长的蓝藻细胞沉淀在4℃下从50ml培养物中以4,300×g离心15分钟（OD 730 =?0.6）。
2. 在通过倾析弃去培养基后，将细胞悬浮在剩余的培养基（约1ml）中。
3. 将细胞悬浮液转移到预称重的1.5ml取样管中
4. 通过在4℃以22,000×g离心10分钟沉淀细胞，然后完全除去培养基。
5. 在使用前将细胞储存在-80℃。
萃取烷烃
1. 冷冻的细胞用真空蒸发器干燥
2. 测量干细胞重量。
  注意：通常获得约20mg干细胞。
3. 将甲醇加入干燥的细胞中注意：我们添加了1毫升甲醇/20毫克干细胞。
4. 通过超声处理破碎细胞（输出：7，总开启时间：6分钟）注意：
  1. 在超声处理期间，样品在冰上，12次30秒，随后30秒的间隔冷却。
  2. 注意，在超声处理过程中，甲醇提取物不会扩散。
5. 将样品在4℃下孵育过夜
6. 通过在22,000×g离心10分钟沉淀细胞碎片 min，然后将上清液转移至新的1.5ml 管。该甲醇提取物含有烷烃注意：准备提取物后，我们立即对提取物进行GC-MS分析。
用GC-MS检测烷烃
1. 500μl甲醇提取物含有烷烃转移到为GC-MS设计的玻璃小瓶中
2. 将样品进行GC-MS。以下是一种气体烷烃（十五烷和十七烷）的色谱法使用a 毛细管柱RESTEK Rtx-1MS（15μm，内径0.25mm）：
  1. 使用氦气作为载气，流速为1.3ml min -1 -1。
  2. 在入口温度为300℃下使用1:100分流*比的氦载气与柱注入8μl样品。
  3. 初始烘箱温度为100℃，3分钟。
  4. 以20℃/min的速率升温至320℃ *注意：应使用设计用于分析分析的玻璃插件。
烷烃定量
对于十五烷和十七烷的定量，我们使用正宗的标准。将这些真实的烷烃标准品用甲醇稀释，然后进行GC-MS以制备标准曲线。通过使用通过GCMSsolution软件计算的峰面积制备标准曲线。使用上述方法的十五烷和十七烷的保留时间分别为?5.6和?7.0min（图1A）。为了鉴定蓝藻提取物中的十五烷和十七烷，将其在色谱图中峰的保留时间和产物峰的断裂模式与真实标准（图1和图2）进行比较。作为代表性数据，使用鱼腥藻显示PCC7120在7分钟时的峰的提取和断裂模式（图2）。为了定量蓝细菌中的十五烷和十七烷，通过GCMS MS软件计算通过GC-MS获得的目标峰的面积，然后使用可信标准的标准曲线测定浓度。如图1C所示，十七烷的标准曲线在0.005-0.5mg/ml的范围内是线性的。对于十五烷也获得类似的线

图1.真实标准品的GC-MS图谱和标准曲线。显示十五烷和十七烷的色谱图（A），十七烷的断裂模式（B）和标准曲线（C） >

<图>图2.A鱼腥藻的甲醇提取物的GC-MS图谱。 PCC7120。 A.色谱图显示主峰出现在7.0分钟。在7分钟时主峰的断裂模式类似于十七烷可靠标准的断裂模式（参见图1B）。

食谱

Anabaena sp。的BG-11培养基。 PCC7120和< em>细长聚球藻PCC7942（Stanier等人，1971）</em> 制备储备溶液（将这些溶液高压灭菌）储液＃1：6.27g的K 2 HPO 4/200ml H 2 O 2 / 储液＃2：15.0g的MgSO 4·7H 2 O 2/200ml H 2 O 2·br/> 储液＃3：7.20g的CaCl 2·2H 2 O·2H 2 O/200ml H 2 O·br/> 储液＃4：4.00g的Na 2 CO 3·3/200ml H 2 O·
储液＃5：1.20g柠檬酸+ 1.20g柠檬酸铁铵+ 0.20g EDTA 2Na/200ml H 2 O 2 / 储液＃6：572mg的H 3 BO 3+ + 362mg的MnCl 2 + 44.4mg的ZnSO 4 > 7H 2 O + 78.0mg的Na 2 MoO 4 2H 2O + 15.8mg的CuSO 4·6H 2 O·5H 2 O + 9.9mg的Co（NO 3） 3 2 6H 2 O/200ml H 2 O
（Hibino et al。，1999）的BG-11培养基+ Turk岛盐溶液（0.5M NaCl）。
为了制备BG-11培养基加特克岛盐溶液（0.5M NaCl），28.17g NaCl，0.67g KCl，6.92g MgSO 4。将5.50g的MgCl 2·6H 2 O·6H 2 O和1.47g的CaCl 2·6H 2 O混合，在用H 2 O调节至1L之前加入H 2 O 2·2H 2 O 2。值得注意的是，蚜藻（Aphanothece halophytica）可以在从0.25到3.0M NaCl的宽范围的盐度中生长。

确认

这项工作部分得到日本教育，科学和文化部科学研究助理和明治大学自然环境科学国际研究中心的支持。

参考文献

Hibino，T.，Kaku，N.，Yoshizawa，T.，Takabe，T.and Takabe，T。（1999）。 DnaK的分子表征来自耐盐藻蓝藻Aphanothece halophytica 用于ATP酶，蛋白质折叠，在各种盐度条件下的铜结合。植物分子生物学 40（3）：409-418。
Kageyama，H.，Waditee-Sirisattha，R.，Sirisattha，S.，Tanaka，Y.，Mahakhant，A.和Takabe，T。通过非生物胁迫改善氮固定和耐盐蓝藻中的烷烃生产烷烃合成基因的遗传操作 Curr Microbiol 71（1）：115-120。
Stanier，R.Y.，Kunisawa，R.，Mandel，M。和Cohen-Bazire，G。（1971）。单细胞蓝绿藻的纯化和性质（Chroococcales订购）。 Bacterial Rev 35（2）：171-205。