材料和试剂

培养皿（90×15mm）
96孔光度计板（Thermo Fisher Scientific，目录号：136101）
铝箔
每个诱导剂治疗至少两个拟南芥（例如生态型哥伦比亚-0）植物
鲁米诺（Sigma-Aldrich，目录号：123072）
来自辣根的过氧化物酶（Sigma-Aldrich，目录号：P8125）
无菌蒸馏水
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：41640）
Flg22（QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA）和elf18（ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG）-EZBiolab（http://www.ezbiolab.com/）
如先前所述（Bellincampi等人，2000）制备的平均聚合度为10至16的OGs。
500x鲁米诺储备液（LSS）（参见配方）
500x辣根过氧化物酶储备液（HPSS）（见配方）
1 mM flg22储备溶液（见配方）
1 mM elf18储备溶液（见配方）

设备

拟南芥生长室
外科刀片
软木钻孔器（0.125cm 2面积）（Sigma-Aldrich，目录号：Z165220）
塑料块
平镊子
GloMax ^? -Multi +检测系统（Promega公司）
Microsart e.jet实验室真空泵（Sartorius AG，??目录号：16612）
塑料或玻璃干燥器

程序

植物材料的制备
注意：每个诱导剂治疗使用至少12片叶片。从每株植物收集至少3-4叶，考虑到，根据叶的大小，可以获得2-3张光盘。在OG处理的情况下，需要四个附加的盘作为阴性对照（见下文）。
1. 在生长室中生长拟南芥植物，直到预先固定阶段（4-5 ?周），在最佳条件（22℃，70％相对湿度，和a 12/12小时光/暗的光周期）
2. 选择和收获适当的叶子（从顶部第三到第五）从至少两个不同的植物，通过从手术切除叶柄刀。用无菌蒸馏水（SDW）轻轻洗涤收获的叶子。
  注意：适当的叶片被定义为来自植物的叶子不具有不同的高度和年龄，由于非同步发芽; ii）没有受伤; iii）不显示由所引起的任何疾病症状 ?土壤真菌和/或细菌的存在。
3. 为了生产叶盘，把叶子放在上面的bur块与midrib在通信 ?的一个孔。打开叶子与软木钻孔器定位正好在孔的上方（见图1A-B）。
4. 收集和恢复叶盘在含有丰富SDW（25ml）的培养皿中培养2小时黑暗条件，通过用铝箔覆盖板。更换 SDW每30分钟（见图1C）。
  注意：在这一点上叶片不需要完全浸入水中。 ?然而，重要的是它们与水相良好接触 ?介质以防止脱水和除去次级代谢物受伤后产生。
5. 轻轻放置，用平镊子，在96孔光度计板中每孔含有一个叶片 200μlSDW（见图1D）。
6. 用铝箔覆盖板，并在生长室中孵育（参见步骤A1的规格）过夜。
  
  图1.植物材料的制备。拟南芥叶A 在中间的水平通过使用块塞和软木钻斧B. 将所得叶盘用培养皿中的25ml SDW漂洗2小时 C，每30分钟更换SDW。然后将叶圆片放入 96孔光度计板，含有200μlSDW D的1个盘/1个孔。
检测flg22-或elf18-触发的H 2 2 O 2亚型生产物
1. 在SDW中制备鲁米诺（LSS）和辣根过氧化物酶（HPSS）的储备溶液（500x）。两种LSS和HPSS的等分试样可以储存在-20℃用于进一步使用
2. 在SDW中制备鲁米诺/过氧化物酶工作溶液（各1.25x）考虑你将需要200微升的这个解决方案为每个井 ?分析。
  例如：对于12个孔，使用SDW将6μlLSS与6μlHPSS混合至2,400μl。使用后，丢弃溶液。
3. 在SDW中制备1 mM flg22或elf18储备溶液（FSS或ESS）。原液可以等分并在-20℃下保存 ?进一步使用。
4. 准备一个5x工作溶液含flg22或 ?elf18（FWS或EWS）;考虑你将需要每孔50μl 和1ml死体积以对注射器充气。诱导者决赛浓度可以在0.1μM和1μM之间。
  示例：对于12 孔混合0.8μlFSS或ESS，最高达1600μl，使用SDW获得0.5μMFWS 或者EWS。使用后丢弃溶液。
5. 轻轻更换200 μl的水与等体积的鲁米诺/过氧化物酶工作溶液在每个含有叶盘的孔中。
  关键步骤：避免叶片伤害确保将叶片完全浸没在中鲁米诺/过氧化物酶溶液。
  注意：自叶盘有疏水表面轻轻地使用移液器吸头，以完全将叶盘的两侧浸入溶液中。
6. 手动将板置于GloMax ^？ -Multi + Detection System（参见图2）。用5x引发剂溶液和等分试样50加入一个注射器 ?μl/孔。
7. 执行发光检测分析至少40分钟，信号积分时间为1秒。
  注意：指示的时间仅指板的读数，即 ?在固定阶段和通过检测以自动化方式进行系统（对于制造商的说明以及视频的 ?如何使用GloMax ^? -Multi + Detection System参考中的链接 ?图2的图例）。
8. 以相对光单位（RLU）表示发光（图3A-B）。
  注意：RLU表示原始数据。
检测OG-触发的H sub 2 O 2子产生
注意：与flg22和elf18相比，OGs是较大的带负电荷的分子。这些特征可能影响它们扩散和进入植物组织，在处理的叶片之间产生不均匀的反应。为了标准化响应，有必要将OGs真空渗入叶盘中。作为对照，通过用水浸润的叶盘评价由真空渗透步骤引起的任何ROS产生。
1. 准备鲁米诺/过氧化物酶工作溶液（每次5x）;考虑你将需要50微升每孔和1毫升死体积充电注射器。
  例如：对于12个孔，混合16μl具有16μlHPSS的LSS和最多1,600μl的SDW。
2. 在SDW中制备含有OGs（OWS）的1.25x工作溶液; 考虑你将需要每孔200μl。最终浓度 OG溶液可以包含在200或300μg/ml之间。
  实施例：对于12个孔，在1,600μlSDW中溶解0.6mg OG以获得250μg/ml OWS。使用后，舍弃解决方案。
3. 轻轻快速更换等体积的200μl水的含有叶片的每个孔中的含OG的溶液。使用4张光盘 ?作为阴性对照，用用于的相同SDW替换水 OG悬浮液。
  注意：不建议分析 ?2基因型每板，因为手动更换所需的时间水与OG溶液可能太长，并且可能发生引起首先处理的盘。在这方面，建议交替 ?含有野生型和突变体（如果在分析中）盘的孔水代替OG悬浮液。
  关键步骤：在真空渗透之前，确保将叶圆片完全浸没在OG溶液中（参见步骤B5）。
4. 立即用OG溶液真空渗入叶盘 ?SDW 2分钟，通过使用连接到真空泵的干燥器。
  注意：确保用鲁米诺/过氧化物酶对注射器充电工作溶液（每次5次），在真空渗透之前或期间。
5. 快速手动将板放在GloMax ^? -Multi + Detection中系统。注射50微升鲁米诺/过氧化物酶工作溶液好。
6. 执行发光检测测定至少40分钟，信号积分时间为1秒。
7. 在RLU中的快速发光（图3C）。
  注意：请参阅步骤B7。

代表数据

图2. GloMax ^? -Multi + Detection System with dual injectors。有关如何使用GloMax点击以下链接： https://ita.promega.com/资源/多媒体/仪器/功能 - glomax-multi /。对于制造商的手册，点击以下链接： https://www.promega.com/~/media/files/resources/protocols/technical手册/0/glomax-multi检测系统协议.pdf。

A）

B）

C）

图3.在诱导子处理的拟南芥叶片中的ROS产生。测量H 2 O 2 O 2亚基产生。（100nM）A），elf18（100nM）B），OGs（200μg/ml）C）处理后，用基于发光氨的测定测定Col-0生态型。结果是平均值±SE [对于诱导剂治疗n = 12; n = 4用于水处理（参见图3C）]。

食谱

500x鲁米诺储备液（LSS）
通过涡旋10-20秒溶解15mg鲁米诺在1ml的DMSO中，直到溶液变得均匀的浅绿色。使用后，等分试样可以储存在-20°C至3个月。
注意：解决方案对光非常敏感。
500x辣根过氧化物酶储备液（HPSS）
通过涡旋10-20秒溶解10毫克过氧化物酶在1毫升水中，直到溶液变得均匀的棕色。使用后，等分试样可以储存在-20°C至3个月。
1mM flg22储备液（FSS-flg22分子量：2272.52）
通过涡旋10-20秒溶解2.27mg flg22在1ml SDW中直到溶液变得透明。
使用后，可将等分试样在-20℃下储存4-6个月。
通过用SDW稀释FSS制备flg22 5x工作溶液（FWS）。
使用后，丢弃溶液。
1mM elf18储备溶液（ESS-elf18分子量：2069.37）通过涡旋10-20秒，溶解2.07mg的elf18在1ml的SDW中直到溶液变得透明。
使用后，等分并在-20°C下储存4-6个月。
通过用SDW稀释ESF制备elf18 5x工作溶液（EWS）。
使用后，丢弃溶液。

参考文献

Bellincampi，D.，Dipierro，N.，Salvi，G.，Cervone，F.and De Lorenzo，G。（2000）。由寡聚半乳糖醛酸苷诱导的细胞外H（2）O（2）不参与生长素的抑制调节的rolB基因在烟草叶外植体中的表达。植物生理学122（4）：1379-1385。