材料和试剂

毛巾
将50ml falcon管（Tubes，50ml，PP）（Greiner Bio-One GmbH，目录号：227 261）
1.5ml管（Safe-Lock管1.5ml）（Eppendorf，目录号：0030120.086）
用于萃取非塑性流体
1. 拟南芥叶（一次重复4g鲜重）
  注意：应使用健康的叶子，优先选择水培或土壤培养。
2. 高压蒸馏水
3. 冰
用于提取叶柄渗出液
1. 拟南芥叶（2-3个叶重复一次）
2. 乙二胺四乙酸（EDTA）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：15576-028）}
3. 氢氧化钾（KOH）（Carl Roth GmbH + Co.，目录号：P747）
4. 10 mM EDTA溶液（见配方）

设备

玻璃烧杯，600ml（Kavalierglass of North America，Simax，目录号：1632417010600）
真空干燥器
带气量计的真空泵（KNF Neuberger GmbH，型号：N022AT.18）
离心机用于50ml管（Centrifuge 5810R）Eppendorf，目录号：5810 000.017）
用于植物栽培的生长室（Percival Scientific，型号：CU-41L4X）

程序

外质洗涤液的提取
1. 至少4g的新鲜叶，对应于约。 60-70叶 ?平均叶片长度为3-4cm，从完整的拟南芥植物中收集。值得注意的是，这些叶片应该是完整的。虽然很幼叶具有较小的细胞间隙，产生较少的外体流体，老叶可能污染具有胞浆的质外体液当膜完整性降低时，从而完全展开叶是理想的。叶被分为3个技术重复约。每个1.3g并转移到50ml falcon管中，然后称重 ?并记录每个样品的新鲜生物量。然后用每个样品洗涤 ?约。 40毫升冰冷的高压灭菌蒸馏水2或3 次（图1A）。
2. 将一个样品的湿叶在37℃下孵育打开的falcon管充满40毫升冰冷的蒸馏水和置于真空干燥器中。叶的细胞间空间然后通过施加-80hPa的真空使其渗透水每次2分钟，使用真空泵（图1B）。方便 ?从叶子中除去气泡，轻轻摇动试管在真空释放后。在干燥器中，保持管 ?冰降低细胞内组分浸出的风险只要叶细胞的质膜是，就可以使用非质外体液损坏或可能已泄漏
3. 所有的水从中除去管，并用纸巾擦干叶组织（图1C）。成功渗透的叶子的部分通常变得透明（图1D）。如果发现叶面积的大部分不是渗透，再次进行真空渗透以填充保留与水的细胞间隙。最后，所有的水滴 ?小心地除去叶子的表面
4. 叶子是转移到新鲜的50ml falcon管中，并将管离心 ?100×g /孔和4℃20分钟。为了更好地分离叶子外部清洗流体，叶子可以卷在saran包裹在一种方式辊朝向底部打开，允许非塑性流体到达离心期间排出（图1E-F）
5. 叶被去除 ?，并且收集的外质性洗涤液被转移到新鲜和预称重的1.5ml管。然后流体的体积通过称重测量。一般来说，10-50微升的质外体液可以通过离心收集
6. 测试可能的细胞内外质洗涤液中的污染物，细胞的活性标记酶如苹果酸脱氢酶或己糖磷酸异构酶可以在流体内测量（Lohaus et al。，，2001）
7. 的收集的外质洗涤液然后准备用于分析矿物元素（ICPert）（Eggert和vonWirén，2013）或氨基酸和其他化合物（Bohner等人，2015）。外质液可以是储存在-20°C几个星期，取决于目标的稳定性 ?化合物
  
  图1.叶外质性洗涤液的提取。新鲜的叶子材料的汇集。 B.浸没叶的孵育样品在真空压力下。 C.擦干叶子以除去水和来自叶表面的液滴。 D.成功渗透叶变得透明。左图显示浸润后的叶子，而in ?右侧图像中，浸润的叶组织标记为红色。 E.叶子 ?后被包裹在萨兰。 Saran包没有关闭底部以允许质外体流体通过。 F.放置 Saran包裹的叶子在离心管。
叶柄渗出物的收集
1. 完整叶片从接近其基部的植物分离（图2A）并称重以测定鲜重。可以栽培植物土壤或在受控条件下的水培。但是，任何增长条件是良好的，只要健康，完整和生理活性叶子。将这些叶子浸入EDTA溶液中，再次切除其叶柄的基部以避免栓塞（图2B）。用纸巾除去叶表面上的液滴。
2. 叶柄 ?的2-3片叶快速转移到装有1.8的2.0ml管中 ml EDTA溶液。如果叶柄短，EDTA的体积溶液可以增加至1.9ml（图2C）。 EDTA用作渗出物 ?收集介质，因为其螯合钙并因此防止重新密封筛管（King和Zeevaart，1974）。由于螯合 ?EDTA的活性在酸性条件下停止，EDTA的pH 溶液用5M KOH调节至8.5
3. 这些叶子保留在生长室中的玻璃容器中例如6小时。在22℃和80-90％ ?湿度和200-280μmolm -2 s -1的光强度^-1以确保正在进行的叶片光合作用。需要高湿度来抑制叶蒸腾和EDTA溶液通过叶柄的吸收。在一般来说，叶柄的渗出速率保持为a 周期1-4 h，6 h后达到平台（King和Zeevaart， 1974）。
4. 除去叶子，叶柄叶分泌物最后使用真空浓缩器或4℃的真空速度浓缩 ?然后再悬浮于较小体积的水，甲醇或任何其中其他类型的溶剂，取决于随后的分析。任何类型 ?的代谢物分析渗出物应储存在≤-20°C。之后 ?收集叶子渗出物，将叶子在55℃的烘箱中干燥直到恒重，并且可以确定叶组织的干重通过称重确定。叶柄叶片渗出可能与之相关新鲜或干重
  
  图2.叶柄的收集 A.叶片与叶片底部的植物分离叶柄。 B.当叶柄浸入时，再次切叶叶柄在10mM EDTA中。将2-3片叶的叶柄浸入10mM EDTA中 ?2ml管中，并在光照条件下保持6小时。

食谱

10mM EDTA溶液
将3.72g EDTA溶于800ml蒸馏水中
用5 M KOH将pH调节至8.5 加蒸馏水至1000 ml

致谢

该方案改编自King和Zeevaart（1974），Corbesier等人（2001），Lohaus等人（2001），Kojima等人的先前发表的研究。 et al。（2007）和Carvalhais等人（2011），并且由Bohner等人（2015）进行。这项工作得到了德国Forschungsgemeinschaft DFG研究单位FOR948（W1728/14）的资助。我们还感谢Lisa Unrath的优秀技术援助。

参考文献

Bohner，A.，Kojima，S.，Hajirezaei，M.，Melzer，M。和vonWirén，N.（2015）。通过DUR3介导的尿素回收促进拟南芥叶片中的尿素再转化from leaf apoplast。 Plant J 81：377-387。
Carvalhais，L.C.，Dennis，P.G.，Fedoseyenko，D.，Hajirezaei，M.R.，Borriss，R.and vonWirén，N.（2013）。受氮，磷影响的玉米的糖，氨基酸和有机酸的根系渗出，钾和铁缺乏。 176植物营养土壤科学176：3-11。
Corbesier，L.，Havelange，A.，Lejeune，P.，Bernier，G。和Périlleux，C。（2001）。韧皮部和木质部的N含量在向开花过渡期间渗出 Sinapis alba 和拟南芥植物细胞环境 24：367-375。
King，R.W。和Zeevaart，J.A。（1974）。通过螯合剂增强切根叶片的韧皮部渗出。植物生理 53：96-103。
Kojima，S.，Bohner，A.，Gassert，B.，Yuan，L.and vonWirén，N。（2007）。 AtDUR3代表高亲和力尿素转运穿过氮缺乏质膜的主要转运蛋白> Arabidopsis 根。植物J 52：30-40
Lohaus，G.，Pennewiss，K.，Sattelmacher，B.，Hussmann，M。和Muehling，K.H。（2001）。渗透离心技术是否适用于分离外质液？对不同植物物种的临界评价。生理植物 111（4）：457-465。