材料和试剂

培养板，24孔（Becton Dickinson Labware，目录号：353047）
注意：目前，"Corning，Falcon
移液管吸头，1,000μl，200μl和10μl体积（Corning，DeckWorks ^TM，目录号：4124,4121和4120）
巴斯德移液管，230mm长（WHEATON，目录号：4500448667）
注意：目前为"WHEATON，目录号：357335"。
锥形管，50ml体积（Corning，Falcon ，目录号：352070）
细胞过滤器，具有100μm孔的尼龙（Corning，BD Biosciences，目录号：352360）
组织培养瓶，150cm 2表面积（T150）（Corning，Falcon ，目录号：355000）
锥形微管，1.5ml体积（Bio Basic Canada，目录号：TC152SN）
活检穿孔器，直径6mm的圆形（Southern Anaesthesia& Surgical，Miltex，目录号：3336）
骨髓抽吸物，人或羊，通过针头抽吸在髂嵴
收集
结晶紫溶液（Sigma-Aldrich，目录号：HT90132）
含有Earle's盐，核糖核苷，脱氧核糖核苷和L-谷氨酰胺的α最小必需培养基（αMEM）（Thermo Fisher Scientific，Corning，Mediatech，目录号：10022CV）
胎牛血清（FBS），在实验室中在56℃热灭活（Life Technologies，Gibco ，目录号：12483）
注意：目前，是"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：12483" />
4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）（1M）（Life Technologies，Gibco ，目录号：15630）注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：15630" />
丙酮酸钠，100mM（Life Technologies，Gibco ，目录号：11360）
注意：目前，是"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：11360" />
成纤维细胞生长因子二（FGF-2），人重组体（Neuromics，目录号：PR80001）
Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（PBS），无菌过滤（Sigma-Aldrich，目录号：D8537）
人血清白蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：A4327）
转化生长因子β3（TGF-β3），人重组体HEK（Prospecbio，ProSpec，目录号：CYT-113）
L-抗坏血酸2-磷酸倍半镁盐水合物（Sigma-Aldrich，目录号：A8960）
地塞米松 - 水溶性（Sigma-Aldrich，目录号：D2915）
L-脯氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：P5607）
台盼蓝溶液，0.4％（Sigma-Aldrich，目录号：T8154）
多孔支架，胶原I或酯化透明质酸（在Bornes等人，2015年详细描述）
青霉素 - 链霉素 - 谷氨酰胺（Life Technologies，Gibco ，目录号：1248310378）（参见配方）
注意：目前，"赛默飞世尔科技，Gibco ^TM ，目录号：1248310378" />
胰蛋白酶 - 乙二胺四乙酸（EDTA）（Thermo Fisher Scientific，Corning，目录号：25052）（参见配方）
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（Sigma-Aldrich，目录号：D6429）（参见Recipes）
胰岛素 - 转铁蛋白 - 硒（ITS +）预混物（Cornig，BD Biosciences，目录号：354352）（参见配方）
膨胀介质（参见配方）
无血清培养基（见配方）
TGF-β3工作溶液（参见配方）
软骨形成介质（参见配方）

设备

生物安全柜（Microzone Corporation，目录号：BK-2-6 A2）
孵育器，其含有在37℃，5％二氧化碳和3％氧气的加湿空气（Thermo Fisher Scientific，目录号：Forma Series II Water Jacket CO 2）
离心机，每分钟1500转（rpm）（Beckman Coulter，AllegraTM，目录号：X-22R）
光学显微镜（显微镜，Omano，目录号：OM159T）
Pipette（Drummond Scientific Company，目录号：Pipet Aid XP）
微量移液管，体积为100-1,000μl，20-200μl，2-20μl和0.5-10μl（Bio-Rad Laboratories，目录号：1660508,1660507,1660506和1660505）
吸引源
镊子
设定为37℃的水浴（VWR International，目录号：89501）
Neubauer血细胞计数器，0.1mm深（Reichert Bright-Line）（Sigma-Aldrich，目录号：Z359629）

程序

涉及操作骨髓抽出物，细胞和多孔支架的方法必须在生物安全柜内进行。与骨髓抽吸物，细胞和多孔支架接触的器械，溶液和介质必须是无菌的。溶液和介质应在浸没在水浴中的密闭容器中预热至37℃。

骨髓基质干细胞的分离和扩增
1. 获得无菌骨髓抽吸物。肝素化人类的集合和髂嵴抽吸物已经在前面详细描述（Buda等人，2010; Bornes等人，2015）。吸出体积15-60 ml 和20-40ml可分别从人和绵羊供体获得（Wakitani等人，2007; Buda等人，2010; Nejadnik等人，2010; Zscharnack等人，2010; Bornes ，，2015）。应该采取Aspirates ?到实验室直接按顺序收集处理 ?以避免细胞死亡
2. 使用100过滤骨髓抽吸物 ?μm细胞过滤器以去除凝块和组织。收集滤液在a 无菌50ml锥形管
3. 对于单核细胞计数，微量移液管50μl稀释的骨髓抽吸液（1:10英寸 PBS;稀释可能必须增加到1:50，如果细胞是高度浓缩）和50μl稀释的结晶紫溶液（1:50的PBS溶液） ?倒入1.5ml锥形微管中并充分混合。微量移液器20μl 的混合物加入血球计。计数单核细胞的数目细胞在血细胞计数器的四个网格正方形内使用光显微镜。将计数的细胞数除以4（网格数在血细胞计数器中的平方），乘以20（稀释的吸出物滤液）并乘以10,000（血细胞计数因子）以计算 ?每毫升抽吸滤液的单核细胞浓度。的然后测定单核细胞的总数浓度乘以吸出物滤液的总体积（以ml计）
4. 计算骨髓抽吸液的体积含15 （Adesida等人，2012）或8000万个绵羊单核细胞（Bornes等人，2015）并移取该体积装入无菌的50ml锥形管中。吸取20ml的膨胀介质进入50ml锥形管并与吸出的滤液混合。转让 ?将吸出的滤液 - 培养基混合物倒入T150烧瓶（第0代）。如果抽吸物中存在大量单核细胞滤液，可以接种多个T150烧瓶
5. 静态孵育 ?每个T150烧瓶在37℃下静置7天。无媒体更改应在此期间执行。
6. 七天后，吸出培养基并用10ml PBS洗涤贴壁BMSCs。吸管将20ml新鲜的扩增培养基加入每个T150烧瓶中。
7. 静态 ?在37℃下孵育每个T150烧瓶，并且每周更换培养基两次 ?直到获得基于显微镜的80％汇合
8. 一旦达到80％汇合，吸出培养基并用10ml PBS洗涤细胞
9. 吸取6毫升胰蛋白酶-EDTA到每个T150烧瓶中并在37℃下孵育 ?℃5分钟。搅动烧瓶以促进骨髓间充质干细胞脱离 ?烧瓶表面。显微镜可用于确认细胞的分离
10. 吸取BMSC胰蛋白酶-EDTA混合物到50毫升锥形管和 ?加入2ml含血清培养基（扩增培养基或含FBS的αMEM） ?以停用胰蛋白酶。
11. 将所得混合物离心10分钟 min（1,500rpm），并抽出液体组分。 BMSC 收集将存在于50ml锥形管的底部
12. 对于BMSC计数，在已知的情况下重新挂起BMSC收集扩增培养基的量（例如10ml）。微量移液器50微升BMSC 收集和50微升锥虫蓝到1.5毫升锥形微管和充分混合。微量移液器20微升的混合物到血细胞计数器。 ?计数四个网格方格内的骨髓基质干细胞的数量血细胞计数器使用光学显微镜。将单元格数除以四个（网格正方形数），乘以2（稀释BMSC 悬浮）并乘以10,000（血细胞计数因子）进行计算细胞（BMSCs/ml悬浮液）的浓度。总数然后通过将该浓度乘以来确定BMSC的数量 BMSC悬浮液的总体积（以ml计）。每个T150烧瓶可以预期为人类供体产生1-3百万个骨髓基质干细胞，3-10万个用于绵羊供体的BMSC
13. 添加扩展介质到骨髓基质干细胞和重新暂停。在第0代期间来自一个T150烧瓶的BMSC应该是 ?重悬于40ml的膨胀介质中并分成两个T150 烧瓶中通过1.在期间共有两个T150烧瓶在通道0期间每个T150烧瓶通道1
14. 对通过1重复步骤A7-12。
15. 添加扩展介质到骨髓基质干细胞并重新挂起。 BMSCs衍生从每个T150烧瓶在第1代应重新悬浮在40毫升 ?膨胀介质并分成两个T150烧瓶用于第2代在每个T150烧瓶的第2代通道期间总共有四个T150烧瓶在通过0期间。
16. 对于第2代BMSC重复步骤A7-12 （图1A-1B）。随后的传代可以超过传代2 以增加可供使用的骨髓基质干细胞的数量，虽然延长 BMSC扩增已经显示导致去分化和丧失的BMSCs的多潜能分化能力（Wagner等人，2008; Tsai等人，2011）。因此，作者建议使用第2节 BMSCs用于软骨形成分化。
多孔生物材料支架与BMSCs和软骨形成分化的种子
1. 多孔支架组成和尺寸应根据目标 ?研究。对于软骨形成的多孔支架的体外评估片由胶原I海绵或酯化透明质酸网组成（Bornes等人，2015）可以使用a切成6mm直径的圆柱体活检穿刺。必须知道所选择的支架的尺寸计算BMSC播种密度
2. 计算骨髓基质干细胞的数量需要产生一千万个BMSCs/cm 3的接种密度脚手架。其他密度可以考虑，虽然作者推荐5-10cm BMSCs每cm 3支架的接种密度 ?用于软骨形成分化。对于圆柱形胶原I 支架直径6毫米和高度3.5毫米，989,602骨髓基质干细胞对于每平方厘米3百万个BMSCs的密度需要每个支架。对于 ?圆柱形酯化透明质酸支架，直径为6 mm，高度为2 mm，每个脚手架需要565,487个骨髓间充质干细胞
3. 在计数第二代BMSCs后，离心所得混合物 10分钟（1,500rpm），并抽出液体组分。 BMSC 收集将存在于50ml锥形管的底部
4. 在具有总体积依赖性的软骨形成培养基中重悬浮BMSCs ?对待接种的支架的数量（图1C）。每6 mm 直径支架，BMSCs（在步骤B2中计算的数字）应当是重悬于20μl软骨形成培养基中
5. 使用镊子将支架置于24孔培养板的空孔中（图1D）
6. Micropipette 20微升BMSC-培养基悬浮液在中心区域的每个支架的平坦表面（图1E）。如果暂停 ?不遍及支架的整个表面，预浸泡支架与20微升无细胞软骨形成培养基可能 ?以促进BMSC-介质悬浮液的完全分散在支架上。如果要使用更大的支架，则多个 BMSC-培养基悬浮液可以被吸取到不同区域上 ?支架促进均匀播种
7. 孵育BMSC种子支架在37℃下15分钟
8. 微量移液器100微升软骨形成培养基到每个BMSC种子支架的基础上
9. 孵育BMSC种子支架在37℃下30分钟
10. Micropipette 1毫升软骨形成培养基到每个孔中，以浸没BMSC种子支架。
11. 将24孔板在37℃静置孵育2-3周。更改软骨形成培养基每周两次。骨髓基质干细胞将分化成细胞能够产生软骨细胞外基质 1F）。
  
  图1.隔离，扩张，接种和软骨形成 BMSCs的分化。 A.组织培养瓶（T150）含有分离的BMSCs和扩增培养基。 B.粘附，人类BMSCs上表现出特征的组织培养瓶的表面扩张期间（10×放大率）的纺锤形形态。 C。重悬浮的骨髓基质干细胞在软骨形成培养基在50毫升锥形管。 D.胶原I脚手架放入使用镊子的24孔培养板的空孔。 E. 将BMSC-软骨形成性培养基悬浮液微量移液到中心 ?面积的胶原蛋白I支架。 F.胞外软骨三周后用safranin O染色的蛋白聚糖软骨形成分化的人类BMSCs接种在胶原蛋白I 脚手架。残余胶原I支架用快速绿染色复染[由Bornes等人（2015）详细描述的染色方案; 10x放大]。

食谱

青霉素 - 链霉素 - 谷氨酰胺 10,000单位/ml青霉素
10mg/ml链霉素 29.2mg/ml L-谷氨酰胺
胰蛋白酶 - 乙二胺四乙酸（EDTA）
0.05％胰蛋白酶 0.53mM EDTA，无碳酸氢钠
钙和镁
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM） 4.5mg/ml葡萄糖 110μg/ml丙酮酸钠
L-谷氨酰胺
胰岛素 - 转铁蛋白 - 硒（ITS +）预混物
625μg/ml胰岛素
625μg/ml转铁蛋白
625μg/ml硒
125μg/ml牛血清白蛋白
535μg/ml亚油酸
扩增培养基，总体积为565ml，终浓度列于
500 mlαMEM
50ml FBS [8.8％体积/体积（v/v）]
5ml青霉素 - 链霉素 - 谷氨酰胺一个。 88.5单位/ml青霉素
b。 88.5μg/ml链霉素 C。 258.4μg/ml L-谷氨酰胺 5ml HEPES（8.8mM） 5ml丙酮酸钠（885.0μM） 282.5μlFGF-2,10μg/ml储备溶液（5ng/ml）
无血清培养基，总体积182 ml，最终浓度列于
166 ml DMEM
2ml HEPES（11.0mM） 2ml青霉素 - 链霉素 - 谷氨酰胺一个。 109.9单位/ml青霉素
b。 109.9μg/ml链霉素 C。 320.9μg/ml L-谷氨酰胺 2ml ITS +预混物
10ml人血清白蛋白，25mg/ml储备溶液（1.4mg/ml）
TGF-β3工作溶液，10ml总体积，最终浓度列于
9.4 ml DMEM
100μlTGF-β3,10μg/ml储备溶液（100ng/ml）
500μl人血清白蛋白，25mg/ml储备溶液（1.3mg/ml）
软骨形成培养基，总体积为100ml，终浓度列于
87毫升无血清培养基
1. DMEM
2. 9.6 mM HEPES
3. 95.6单位/ml青霉素
4. 95.6μg/ml链霉素
5. 279.2μg/ml L-谷氨酰胺
6. 1ml ITS +预混物
10ml TGF-β3工作溶液
1. DMEM
2. 10.0ng/ml TGF-β3
3. 125μg/ml人血清白蛋白
1ml抗坏血酸2-磷酸盐，3.65mg/ml储备溶液（365μg/ml）
1ml地塞米松，10μM储备溶液（100nM） 1ml L-脯氨酸，4mg/ml储备溶液（40μg/ml）

致谢

与该方案有关的研究由阿尔伯塔大学医院，加拿大卫生研究院和埃德蒙顿骨科研究委员会的大学医院基金会资助。 Integra LifeSciences公司和Anika Therapeutics公司为我们的实验室慷ously地提供了实物生物材料。 Stubend对Troy Bornes的支持由Alberta Innovates - 健康解决方案和加拿大健康研究所提供。

参考文献

Adesida，A.B.，Mulet-Sierra，A。和Jomha，N.M。（2012）。低氧介导的分离和扩增增强了骨髓间充质基质细胞的软骨形成能力。 em> Stem Cell Res Ther 3（2）：9.
Bornes，T. D.，Adesida，A. B.和Jomha，N. M.（2014）。间充质干细胞在创伤性关节软骨缺损的治疗中：综合评价。 em> Arthritis Res Ther 16（5）：432.
Bornes，T.D.，Jomha，N.M.，Mulet-Sierra，A。和Adesida，A.B。（2015）。骨髓间充质间质干细胞的缺氧培养在体外差异增强[em] >细胞接种的胶原和透明质酸多孔支架内的软骨形成。 Stem Cell Res Ther 6：84.
Buda，R.，Vannini，F.，Cavallo，M.，Grigolo，B.，Cenacchi，A.and Giannini，S。（2010）。膝盖骨软骨病变：使用骨髓衍生细胞的新一步修复技术。 J Bone Joint Surg Am 92（Suppl 2）：2-11。
Nejadnik，H.，Hui，J.H.，Feng Choong，E.P.，Tai，B.C.and Lee，E.H。（2010）。自体骨髓间充质干细胞与自体软骨细胞植入：观察性队列研究。 Am J Sports Med 38（6）：1110-1116。
Tsai，C.C.，Chen，Y.J.，Yew，T.L.，Chen，L.L.，Wang，J.Y.，Chiu，C.H。和Hung，S.C。缺氧抑制衰老并通过HIF-TWIST下调E2A-p21维持间充质干细胞特性。 Blood 117（2）：459-469。
Wagner，W.，Horn，P.，Castoldi，M.，Diehlmann，A.，Bork，S.，Saffrich，R.，Benes，V.，Blake，J.，Pfister，S.，Eckstein， Ho，AD（2008）。间充质干细胞的复制性衰老：连续而有组织的过程。一个 3（5）：e2213。
Wakitani，S.，Nawata，M.，Tensho，K.，Okabe，T.，Machida，H.and Ohgushi，H。（2007）。用自体骨髓间充质细胞移植修复髌股关节中的关节软骨缺损：三例报告涉及五个膝盖中的九个缺陷。 J Tissue Eng Regen Med 1（1）：74-79。
Zscharnack，M.，Hepp，P.，Richter，R.，Aigner，T.，Schulz，R.，Somerson，J.，Josten，C.，Bader，A.and Marquass，在羊模型中使用预分化间充质干细胞修复慢性软骨缺损 Am J Sports Med 38（9）：1857-1869。