材料和试剂

12毫米玻璃盖片
24孔板
移液器提示
聚-L-赖氨酸氢溴酸盐（PLL）（Sigma-Aldrich，目录号：P1274）
层粘连蛋白小鼠蛋白质（Invitrogen，目录号：23017-015）注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：23017-015"。
HBSS-CMF（HBSS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：14185-052）
胶原酶II（Worthington Biochemical Corporation，目录号：4176）
Dispase II（Roche Diagnostics，目录号：04942078001）
青霉素 - 链霉素（Invitrogen，目录号：15140122）注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：15140122"。
B-27 无血清补充剂（50x）（Invitrogen，目录号：17504-044）
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：17504-044"。
Glutamax（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：35050）
Neurobasal-A（Invitrogen，目录号：10888-022）注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：10888-022"。
1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Roche Diagnostics，目录号：11-666-789-001）
4％多聚甲醛（PFA）（Electron Microscopy Sciences，目录号：15710-S）
小鼠产生的单克隆抗β微管蛋白III抗体（msIgG2b）（Sigma-Aldrich，目录号：T8660）
山羊抗小鼠IgG2b 594（Invitrogen，目录号：A21145）注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Novex ^TM ，目录号：A21145"。

设备

37℃，5％CO 2强制空气培养箱
解剖显微镜
外科工具
1. 镊子（Fine Science Tools，目录号：11254-20）
2. Microscissors（Fine Science Tools，目录号：15003-08）
3. Rongeurs（Fine Science Tools，目录号：16021-14）
移液器
血细胞计数器
微量离心机

程序

预先盖片
1. 将12毫米玻璃盖玻片放在24孔板（每孔1盖玻片）
2. 用聚-l-赖氨酸（0.1mg/ml; PLL）将盖玻片涂覆在室温下过夜或在37℃下2小时。
3. 从孔中的盖玻片上取下PLL。
4. 向每个孔中加入ddH ₂ O以洗涤盖玻片
5. 使用移液管或吸力管移除ddH 2 O。不要让盖玻片 ?完全干燥。一旦从盖玻片除去ddH 2 O，立即 ?移至下一步。
6. 将层粘连蛋白（5μg/ml）在HBSS-CMF中的盖玻片孵育并在37℃孵育2小时，然后铺板细胞。注意：
  1. 可以改变层粘连蛋白的浓度以增强或减少生长潜力。
    虽然解离的成年DRG神经元在该浓度下生长良好，可以用更高的层粘连蛋白浓度获得更长的生长，而增长的神经元对较低的层粘连蛋白浓度将提供更具挑战性的底物用于生长。
  2. 层粘连蛋白应保留在盖玻片上，直到细胞准备好平板。没有必要洗一旦层粘连蛋白被去除后，盖玻片。
  3. 神经元可以镀 ?直接在层粘连蛋白包被的盖玻片上，或电镀在单层上细胞以检查神经突向外生长对细胞的影响底物。
7. 电镀单层细胞
  1. 单层的可以通过对感兴趣的细胞类型进行致密铺板来产生细胞（星形胶质细胞，干细胞，等）到盖玻片上发生层粘连蛋白涂层。
  2. 要创建单层，浓缩 ?60,000个细胞/60μl培养基。（该浓度可以更大或更小 ?这取决于特定细胞的细胞分裂速率人口。）
  3. 从盖玻片上去除层粘连蛋白（步骤A6）。
  4. 把整个60微升的细胞滴到盖玻片的中心并使板在RT下保持不变30分钟。这会允许细胞一些时间粘附到盖玻片。
  5. 之后 30分钟孵育，轻轻地添加额外1毫升培养基下侧以便最小化细胞的分散或破裂溶液在滑移的中心。
  6. 允许细胞在37°C孵育过夜，然后加入DRG神经元。
解离DRG神经元
1. 从成年小鼠或大鼠中取出所有DRG
2. 修剪中央和外围根。
3. 将DRGs放入含有胶原酶的1.5ml微量离心管中 ?II（200U/ml）和分散酶II（2.5U/ml）的HBSS-CMF。 Dispase /胶原酶有助于消化神经节周围的硬脑膜，允许细胞体彼此完全解离。
4. 在37℃下孵育1小时。
5. 从培养箱中取出DRG，离心样品2分钟，5600 RPM
6. 轻轻除去上清液并丢弃。小心不要打扰含有细胞的沉淀。
7. 加入新鲜CMF溶液（约1毫升）到微量离心管含有沉淀，轻轻研磨，然后离心2分钟， 5,600 RPM。
8. 重复步骤B6-7两次（总共洗涤3次）。
9. 第三次洗涤后，将解离的神经元重悬在1ml的补充有B-27，GlutaMAX和G-的Neurobasal-A培养基青霉素 - 链霉素注意：细胞解离后（步骤B3），重要的是及时完成后续步骤时尚（它应该需要大约20分钟），以尽量减少神经元死亡 ?在洗涤期间。如果需要，在此期间保持细胞在冰上过程。
10. 使用血细胞计数器，计数样品中存在的神经元细胞体的数量
11. 在盖玻片上以每个盖玻片1,500-2,000个神经元的浓度（在每个盖玻片1ml Neurobasal-A中）平板神经元。
  注意：神经元可以在2小时后涂覆在层粘连蛋白包被的盖玻片上涂层他们。通常在开始DRG之前添加层粘连蛋白分离和解离将允许用于衬底的大量时间以坚持盖玻片。
12. 在37℃孵育24小时。
电镀细胞用于神经突增生
1. DRG电镀24小时后，从孔中取出培养基
2. 在室温下加入?500ml 4％PFA 30分钟
3. 删除PFA。
4. 用1x PBS洗涤3×10分钟。
5. 在4℃封闭盖玻片过夜。
6. 用β-III微管蛋白（在块+ triton中1:500）在4℃下培养过夜或在室温下2小时。
7. 用1x PBS洗涤培养物3次，每次10分钟。
8. 用适当的二抗在4℃下染色过夜或在室温下染色2小时。
9. 将盖玻片装载到载玻片上。
  1. 要安装盖玻片，使用一对尺寸3的珠宝商的镊子小心地将盖玻片从井的侧面提起。一定要保留轨道的盖玻片的哪一侧包含细胞
  2. 用镊子小心地抓住盖玻片的边缘。小心不抓住盖玻片的中心或你会刮掉细胞
  3. 翻转盖玻片面朝下，将盖玻片放置在幻灯片上。
  4. 用清晰的指甲油密封盖玻片的边缘，让载玻片干燥。
10. 图像所有神经元与进程。
测量神经突生长
1. 使用MetaMorph软件，测量每个神经元的最长神经突。这个可以使用跟踪线或多线工具。
  1. 打开MetaMorph软件。
    
    图1.打开屏幕
  2. 要测量神经突，打开"区域测量"
    
    图2.裁剪区域测量
  3. "区域测量"窗口应打开。选择"活动区域"以查看最近测量的神经突的长度。
    
    图3.活动区域
  4. 转到"测量"。单击"校准距离"。
    
    图4.校准距离
    
    注意：距离可能需要根据范围和放大用于图像神经元。必须进行校准建立了每个使用的目标。这些校准将基于不同范围。因此，对于每个范围和每个目标，校准必须确定并添加到列表中。
    选择与用于对正在测量的神经元成像的适当显微镜和物镜对应的校准
    
    图5.校准距离屏幕
  5. 打开要测量的图像。
    
    图6.图片已打开
  6. 使用跟踪或多线工具，跟踪过程，在细胞体附近开始，延伸到过程的末端。进程经常分支，所以一定要遵循适当的路径（最长的过程）。
    
    图7.跟踪工具
    
    图8.多行工具
  7. 一旦跟踪整个过程，双击。这将显示"区域测量"或刚刚跟踪的神经突的长度。它将显示在图像上以及区域上测量窗口。
    
    图9.开始点击
    
    确保"活动区域测量"显示在"区域测量"窗口中以查看测量最近测量的神经突
    
    图10.活动区域
    
    图11.完成测量

笔记

为了确定每个神经元的最长神经突，通常每个神经元的多个神经元将必须被测量，然后选择那些测量的最长。根据神经元的密度和位置，可能难以确定特定神经突是来自一个神经元细胞体还是来自另一个神经元细胞体。如果不能确定来源的细胞体，从分析中排除那些神经突/神经元。

致谢

该协议在Filous等人使用。（2014）。这项工作得到国家卫生研究院 - 国家神经疾病和卒中拨款研究所NS025713，国立卫生研究院训练基金T32和纽约州卫生部和Brumagin纪念基金的支持。

参考文献

Filous，A.R.，Tran，A.，Howell，C.J.，Busch，S.A.，Evans，T.A.，Stallcup，W.B.，Kang，S.H.，Bergles，D.E.，Lee，S.I.，Levine，J.M.and Silver，通过NG2蛋白多糖⁺细胞和营养不良性轴突之间的突触样连接在损伤中在脊髓损伤后的再生衰竭中起作用。 J Neurosci 34（49）：16369-16384。