第I部分。用于GST-Gal3纯化的方案（Harper和Speicher，2011）

材料和试剂

微量离心管（Denville Posi-Click Tubes，目录号：C-2170）
15ml锥形管（Thermo Fisher Scientific，Corning Centristar，目录号：05-538-59A）
10ml血清移液管（Thermo Fisher Scientific，Corning Costar，目录号：4488）
One Shot ^? BL21 Star ^TM（DE3）Chemically Competent 大肠杆菌（Thermo Fisher Scientific，目录号：C6010-03）
pGEX 2T-Gal3载体（由Dr.W.Stallcup，UCSD，CA提供）
L-broth（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP1426-2）
谷胱甘肽 - 琼脂糖珠（Thermo Fisher Scientific，Pierce ^TM，目录号：16100）
蛋白酶抑制剂片，无EDTA（Thermo Fisher Scientific，Pierce ^{TM，目录号：88665）}
冰
纯化水
10x PBS，稀释至1x（Thermo Fisher Scientific，Hyclone，目录号：BP3994）
异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）（Gold Biotechnology，目录号：12481C25）
Tris-Cl（pH7.5）
150mM NaCl
0.75％CHAPS粉末（AG.Science，目录号：C-1019）
0.75％CHAPS缓冲液（见配方）

设备

Microfuge（Beckman Coulter，型号：Microfuge 16）
37℃振荡器（FormaOrbital Shaker）
Shaker（GMI，Lab Companion，型号：SK-300振动器）
旋转平台（24 rpm）（基准型号：MiniMixer）
Vortex（Thermo Fisher Scientific，目录号：12-812）注意：目前，它是"LabX，目录号：12-812"。
离心机（Beckman Coulter，型号：Avanti J-20 XP）
离心转子（Beckman Coulter，型号：JLA-16.250）
离心机（Beckman Coulter，型号：Allegra 25R）
离心转子（Beckman Coulter，型号：TS-5.1-500）
250ml塑料离心瓶（Sigma-Aldrich，Nalgene ，型号：B1033）
2升烧瓶（Corning，Pyrex ，型号：No.4980）
10ml血清移液管（Corning，Costar ，目录号：4488）

程序

用pGEX-2T-Gal3表达载体转化BL21细菌，挑选菌落并用适当的限制性消化（BamHI和EcoRI）验证质粒DNA。质粒的大小为5,697bp;半乳凝素-3插入片段的大小为753bp（参见地图，补充图1 ）。
使用一个菌落接种3ml清洁，高压灭菌的Luria-broth并在37℃下以250rpm生长过夜直到OD 600 = 1.0。
在2L烧瓶中，加入1,000ml水。测量25 g Luria Broth，加入烧瓶中的水中。在使用前进行高压灭菌（见第2步）。
将0.3ml转化的细菌加入Luria Broth中。
在37℃以250rpm生长4-5小时，直到OD 600 = 0.6
接下来，用0.5mM IPTG（119.2mg）诱导细菌，并允许在振荡器上在室温下以200rpm生长过夜，持续16-18小时。
将细菌在4℃下以5,000rpm旋转15分钟，直至沉淀，将细菌转入四个，250ml塑料离心瓶中。弃去上清液。将丸放在冰上。（如果你想在这里停止，丸剂可以储存在-80℃直到裂解。在裂解前，将冷冻的丸粒在37℃水浴中温育10分钟）。
在冰上，制备CHAPS裂解缓冲液
将两种蛋白酶抑制剂片剂加入到50ml CHAPS裂解缓冲液溶液中，并通过涡旋将片剂溶解在缓冲液中
在冰上，向每个沉淀物中加入12ml CHAPS裂解缓冲液
通过吸移和涡旋破碎沉淀，直到混合物光滑。首先涡旋以从离心机瓶壁分离沉淀，然后使用10ml血清移液管通过上下吹打以进一步破坏沉淀，形成均匀的溶液。
允许裂解在冰上继续30分钟。裂解期间每五分钟涡旋一次（共六次）。
当细菌裂解发生时，在15ml锥形管中加入2ml谷胱甘肽 - 琼脂糖珠浆液到13ml纯水中。通过倒管混合2?3次。让珠子在冰上膨胀30分钟。
将细菌裂解物分配到微量离心管（每管约1.5ml裂解物，约30管）。或者，可将裂解物置于50ml离心管中。
旋转微量离心管在14,000 rpm在4℃15分钟。上清应清晰。如果使用50ml离心管，在4℃下以3500rpm旋转15分钟。然后建议将得到的上清液转移到微量离心管中并以14,000rpm离心10分钟。
使用微量移液管，从丸粒分离上清液。丢弃颗粒。
将来自所有微量离心管的上清液倒入两个15ml锥形管中
轻轻地从膨胀的琼脂糖珠上吸出过量的水（珠应该放置在瓶底部;如果不能快速离心10-20秒而不超过1000rpm，因为高速会损坏珠子）。
加入10ml CHAPS裂解缓冲液到珠子平衡。混合通过倒置管几次。简单离心，不超过1,000 rpm。
从琼脂糖珠中轻轻吸出过量的缓冲液
向琼脂糖珠中加入?1ml CHAPS裂解缓冲液，使得珠体积和缓冲液体积相等（50％v/v）。混合珠和缓冲液，通过倒置管几次
向每个含有细菌裂解上清液的15ml锥形管中加入1ml珠/缓冲溶液。移液器尖端应切割成珠子以适应。
通过倒置管数次混合珠和裂解上清液
在4℃下在缓慢旋转的平台（24rpm）上孵育过夜
第二天，将上清液和珠子短暂离心，不超过1,000rpm，在4℃下?10秒钟以沉淀珠子。除去上清液并保存，因为它可能仍含有一些蛋白质，如果需要进一步分析，可能有用
通过加入14毫升1×PBS到每个管洗涤GST蛋白结合珠。反转混合。如果珠子粘在试管底部，用手指轻轻摇动试管以移动珠子。
在不超过1,000rpm的条件下短暂离心以使珠沉降。取出1×PBS，并用另一只14 ml 1×PBS再次洗涤
删除1x PBS。珠子应该包含你的GST融合蛋白
使用考马斯染色的12％聚丙烯酰胺SDS-PAGE凝胶和/或蛋白质印迹（参见图2）评估rGST-Gal3蛋白的完整性和产量。
在4℃下将珠子储存在50％v/v CHAPS缓冲液（?1ml珠子，?1ml CHAPS缓冲液）中直至进一步使用或进行凝血酶切割以分离半乳凝素-3。

食谱

0.75％CHAPS缓冲液
1.2g（30mM）Tris-Cl（pH7.5） 2.2克（150mM）NaCl 1.9g（0.75％）CHAPS粉末
用水
填充至250 ml

第二部分。凝血酶介导的GST从GST-Gal3切割的方案

材料和试剂

Microfuge管（DENVILLE SCIENTIFIC，目录号：C-2170）
375 U凝血酶（Merck Millipore Corporation，Calbiochem ，目录号：605195）
与rGST-Gal3结合的谷胱甘肽 - 琼脂糖珠
对氨基苯甲脒琼脂糖珠[50％（V/V）]（Sigma-Aldrich，目录号：A7155）
Tween-20（Thermo Fisher Scientific，Fisher Bioreagent，目录号：BP337-500）
冰
10x PBS，稀释至1x（Thermo Fisher Scientific，Hyclone，目录号：BP3994）
商业半乳凝素-3（Peprotech目录号：450-38,50ng）
抗半乳凝素-3第一抗体（在含2.5％BSA的PBST中1:800，Santa Cruz，20157）
鸡抗兔二抗（在含有2.5％BSA，Santa Cruz，sc-2955的PBST中为1:10,000）
PBST（0.1％Tween 20）（参见配方）

设备

旋转平台（24rpm）（Benchmark Scientific，型号：MiniMixer）
Microfuge（Beckman Coulter，型号：Microfuge 16）

程序

在冰上，在微量离心管中的CHAPS缓冲液（100μl总体积/管）中向100μl50％v/v rGST-Gal3结合的琼脂糖珠中加入500μlPBST。
在冰上，通过将375U凝血酶稀释到800μlPBST中来制备凝血酶溶液
向每个微量离心管中加入400μl的凝血酶溶液，每个微量离心管的最终体积为1 ml
将管放置在旋转平台（24 rpm），并允许在室温下孵育过夜
第二天，通过向15ml离心管中加入必需量的对氨基苯甲脒浆液（250μl珠浆液/100μlrGST-Gal3结合的琼脂糖珠），在1×PBS中洗涤对氨基苯甲脒珠，然后将管填充到15ml 1x PBS。通过倒置混合，然后短暂离心，不超过1000转/分
取出1×PBS，然后重复用新鲜的1×PBS清洗
取出PBS，然后加入足够的新鲜1×PBS，使珠和1×PBS形成50％v/v溶液。
在台式微量离心机中以3500rpm离心珠/凝血酶溶液1分钟。除去上清液，并放入新鲜的1.5毫升微量离心管。
向每个含有上清液的微量离心管中加入250μl对氨基苯甲脒琼脂糖珠浆液，以从溶液中除去凝血酶。
在室温下在旋转平台（24rpm）上将对氨基苯甲脒珠与上清液孵育1.5小时。
Microfuge管在3500rpm，?30秒。
收集上清液。蛋白质将在上清液中，而附着在珠粒上的凝血酶将被沉淀物消除
用考马斯染色的SDS-PAGE和Western印迹评估上清液蛋白质组成（图1-2）

图1.通过与凝血酶蛋白酶温育，半乳凝素-3从GST成功裂解。泳道1-3显示通过凝血酶处理从GST切割的Galectin-3（1μl，2μl，4μl;约150,300,600ng）的体积增加。泳道5显示商业半乳凝素-3。通过在12％聚丙烯酰胺凝胶上的SDS-PAGE，随后通过蛋白质印迹分析样品。用兔，抗半乳凝素-3一抗（在含2.5％BSA的PBST中1:800）和鸡抗兔二抗（在含2.5％BSA的PBST中1:10000）进行免疫印迹。

图2.通过考马斯染色的凝胶电泳分析rGST-Gal3的凝血酶切割。泳道1显示?25kDa的阳性对照人半乳凝素-3。泳道2显示没有被凝血酶切割的GST-Gal3。 GST-Galectin3融合蛋白的大小约为50kDa。泳道4-6显示从GST切割的半乳凝素-3的增加量（0.94μg，1.88μg，3.75μg，通过Bradford Assay测定）。

食谱

PBST（0.1％Tween 20）
每100 ml 1x PBS加入100μlTween-20

致谢

我们感谢William Stallcup博士（Sanford-Burnham医学研究所;癌症中心; La Jolla，CA USA）提供GST-Gal3表达质粒。这项工作是由R01授予CA163722从NIH（到EGVM）支持。

参考文献

Cummings，R.D。，和Liu，F.T。（2009）。半乳凝素。 In：Varki，A.，Cummings，R.D.，Esko，J.D.，Freeze，H.H.，Stanley，P.，Bertozzi，C.R.，Hart，G.W.and Etzler，M.E。 Essentials of Glycobiology（第二版）。冷泉港。
Harper，S.and Speicher，D.W。（2011）。纯化与谷胱甘肽S-转移酶融合的蛋白质 /em> 681：259-280。
Nangia-Makker，P.，Balan，V。和Raz，A。（2008）。通过细胞外半乳凝素-3调节肿瘤进展。癌症微环境em> 1（1）：43-51。
Newlaczyl，A.U。和Yu，L.G。（2011）。 Galectin-3 - 一种癌症中的全能性。 < em> Cancer Lett 313（2）：123-128。
Wen，Y.，Makagiansar，I.T.，Fukushi，J.，Liu，F.T.，Fukuda，M.N.and Stallcup，W.B。（2006）。 NG2蛋白多糖和半乳凝素-3之间的相互作用的分子基础 J Cell Biochem。98（1）：115-127。