材料和试剂

70μm尼龙网孔细胞过滤器（Thermo Fisher Scientific，Fisherbrand ^TM，目录号：22363548）
5ml聚丙烯圆底FACS管（BD Falcon ，目录号：352063）
注意：目前，它是"康宁，目录号：352063"。
50μm圆锥形聚丙烯管（BD Falcon，目录号：352098）注意：目前，它是"康宁，目录号：352098"。
96孔板，U底（BD，Falcon ，目录号：353077）
注意：目前，它是"康宁，目录号：353077"。
小鼠
1. （Jackson Laboratories，目录号：006772）（参见注释1）的B6-FoxP3 EGFP 株（B6.Cg-Foxp3 tm2Tch
2. Rag KO（Rag 1 KO，B6.129S7-Rag 1tm1Mom ）（Jackson Laboratories，目录号：002216）
无生物防腐剂的8x鞘液浓缩液（细胞分选机）[Cedarlane，目录号：1027（BS）]
Hank's平衡盐溶液（HBSS）（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：14170）
注意：目前，它是"Thermo Fisher Scientific，目录号：14170"。
胎牛血清（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：16170078）
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：16170078" />
1 M HEPES（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：15630080）
注意：目前，"赛默飞世尔科技，Gibco ^TM ，目录号：15630080" />
PE抗小鼠CD8a（克隆53-6.7）（eBioscience，目录号：120081）
APC抗小鼠CD4（克隆GK1.5）（eBioscience，目录号：170041）
PerCP-eFluor 710抗小鼠CD4（克隆RM4-5）（eBioscience，目录号：460042）
APC-eFluor 780抗小鼠TCRβ（克隆H57-597）（eBioscience，目录号：475961）
Ultracomp eBeads（eBioscience，目录号：012222）
"Fc阻断"抗体，抗小鼠CD16/CD32（克隆2.4g2）（9.6mg/ml）（Bio X cell，目录号：CUS-HB-197）
功能级纯化的抗小鼠CD3ε（克隆145-2C11）（eBioscience，目录号：160031）
Celltrace紫细胞增殖试剂盒（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：C34557）
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^TM ，目录号：16170078" br />
LIVE/DEAD可固定黄色死细胞染色试剂盒（Life Technologies，Invitrogen ，目录号：L34959）或7-氨基放线菌素D（7-AAD）（Sigma-Aldrich，目录号：A9400） /> 注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^TM ，目录号：L34959" br />
18MΩ^。 cm去离子水
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：11965）
注意：目前，"赛默飞世尔科技有限公司，目录号：11965" />
Pen/strep（100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素）（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：15140122）
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非必需氨基酸（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：11140050）
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：11140050" />}
丙酮酸钠（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：11360070）注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：11360070" />}
L-谷氨酰胺（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：25030081）注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：25030081" />}
2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M3148）
富含DMEM（E-DMEM）（参见配方）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见配方）
ACK裂解缓冲液（见配方）

设备

细胞分选仪（BD Biosciences，型号：BD Influx）
具有405nm激发能力的流式细胞仪（参见注释3）（BD Biosciences，型号：BD LSR II）
37℃湿润培养箱，5％CO 2/h
离心机（能够旋转50ml锥形管，5ml FACS管和96孔板）
多通道移液器（30-300μl）（Eppendorf）

程序

单元格准备
注意：涉及动物的所有程序必须根据经过适当培训和认证的人员的认可机构，地区或国家协议（如适用）进行。
1. 安乐死小鼠颈椎脱位和无菌取出脾
2. 通过标准方法准备脾细胞。我们使用坚定但温和通过70微米的尼龙网过滤篮破坏脾脏柱塞从3ml注射器，保持组织潮湿和洗涤细胞通过HBSS + 2％FBS。对于红细胞裂解，通过在?320×g离心5-10分钟在RT下沉淀细胞。重悬细胞沉淀在2-5毫升ACK裂解缓冲液在室温下 ?5分钟，通过涡旋进行周期性混合，然后加入?10体积（20-50ml）HBSS + 2％FBS，并在?320×g下旋转5-10分钟，室温。
3. 重悬细胞在HBSS + 2％FBS室温。添加Fc 封闭抗体，并等待5分钟。添加APC抗CD4和PE抗CD8 抗体并在室温下孵育?30分钟。 [通常我们重悬来自4只成年小鼠的脾细胞在2ml缓冲液中，并使用25μlFc块抗体储液（0.24mg），25μlAPC抗CD4（5μg），50μlPE-抗CD8 （10μg）。]
4. 在?320×g下旋转细胞5-10分钟，室温。洗涤细胞1x ?与至少10个染色体积（即，：> 20ml）的HBSS + 2％FBS。
5. 在足够的HBSS + 20％FBS + 10mM HEPES中重悬脾细胞得到?15×10 6个细胞/ml的浓度。过滤细胞通过70μm ?尼龙网过滤器，将细胞置于冰上
6. 继续排序 CD4单阳性（SP）GFP和CD4 SP GFP +细胞群体 ?分入含有约1ml的99％FBS + 1％1M的单独的5ml FACS管中 ?HEPES（终浓度10mM）。排除基于FSC-H vs的双峰 FSC-A图。强调纯度高于产量。存储管排序从分选机中取出后，冰上的细胞。我们发现它不是必须在分拣机上收集时冷却试管
7. 通过流式细胞术评估分选的细胞群体的纯度。来自一个野生型小鼠脾脏的CD4 +细胞的典型产量分选大约是7×10 5个细胞。 CD4 +细胞的典型产量 ?从分选后的一个野生型小鼠脾脏约5×10 6个细胞
测试设置
1. 计数，在?320×10 5细胞/cm旋转细胞5-10分钟，并重悬CD4 + GFP ⁺（FoxP3 < （2×10 6个细胞/ml）的浓度的E-DMEM中的"抑制剂"（"抑制剂"）。置于加湿的37℃，5％CO 2培养箱中管准备响应细胞时松动。
2. 计数和洗涤（在?320×g离心细胞5-10分钟，然后在室温下重悬）溶液指定）在HBSS或PBS中的CD4 ⁺ GFP ^-（FoxP3 ^-，"应答者"）（无血清）两次。标签大约是你的单元格数量的两倍 ?将需要测定，因为它是常见的失去一个显着在Celltrace紫色（CTV）标记过程中您的细胞比例处理。取出未标记的细胞（约5×10 5个细胞，重悬于500μl的E-DMEM）的等分试样，用作2个对照用于随后流式细胞术分析（非CTV染色，仅有活体染色; 完全未染色;图1分别为孔E7和E8）。这些细胞应该在37℃下在潮湿的5％CO 2培养箱中储存可以直接加入到测定板的适当孔中 ?储存直至在15ml或50ml锥形管中的测定装置孵育器与帽子松散。有关使用的讨论见注4 的非分级脾细胞作为应答者。
3. 用CTV标记CD4 ⁺ GFP ^-细胞。简言之，制备5mM CTV储备溶液根据制造商的说明加入20μl的供应（室温）DMSO至干燥CTV染料的等分试样并混合 ?彻底。通过稀释储备1/1,000制备5μM工作溶液在预热（37℃）HBSS或PBS中。重悬浮沉淀，洗涤 CD4 + sup/+细胞在工作溶液中的浓度为1-15 ?x 10 6个细胞/ml，确保完全和快速的细胞沉淀破坏/ 通过血清移液管研磨重悬浮。孵化为 ?在37℃水浴中20分钟。
4. 猝灭标记反应加入5倍体积的冷DMEM + 10％FBS。然后在RT孵育5分钟用E-DMEM洗涤细胞1×并重悬于预热的（37℃）E-DMEM中。在37℃在潮湿的5％CO 2培养箱中孵育至少15分钟。
5. 用25-50ml温热的E-DMEM洗涤细胞，计数并在E-DMEM中以1×10 6个细胞/ml重悬。
6. 在进行标记反应时，制备抗原呈递细胞（APC），通过对Rag KO小鼠实施安乐死，去除脾，并如前所述用RBC裂解制备脾细胞。洗，计数，并将这些细胞以2×10 6个细胞/ml重悬于E-DMEM中。
7. 设置测定板（见表1和图1）：
  96孔U型底部测定板中使用的每个孔应包含：
  1. 1 x 10 ⁵响应T细胞
  2. 1×10 5（Treg：Tresp比率1：1），5×10 4 sup（1：2），2.5×10 4 sup/（1:4），1.25×10 4（1:8），6.25×10 3（1:16）或0（0:1）抑制T细胞， br />
  3. 1μg/ml抗CD3ε抗体
  4. 1×10 5抗原呈递细胞（来自上述步骤B13中制备的Rag KO动物的RBC缺乏的脾细胞）
  5. 充足的E-DMEM培养基，使每孔最终体积为250μl 注意：每个条件应至少一式三份进行测定。尝试避免使用它们受到的测定板的边缘孔增加蒸发速率。记住包括2套井不含Treg和没有抗CD3ε刺激：一组将作为未刺激的对照（图1，孔B6-B9），另一个将被使用 ?作为在后期流动期间CTV污迹的补偿控制细胞计数分析（图1，孔D7-D9）。添加标记的非CTV 从步骤9保存的细胞至测定板的两个孔（图1，孔 ?E7-E8）。
    
    表1.抑制测定设置指南 - 每个孔包含以下卷中的每个条件的组件左栏
    
    图1.典型抑制的示例板布局 ?实验设置为一式四份。比率是表示为Treg：Tresponders。
8. 孵育测定板在37℃，5％CO 2加湿培养箱中5天。
染色
1. 在约400×g离心试验板5分钟。
2. 通过快速"轻拂"运动，将孔中的上清液移至批准的容器中
3. 使用多通道移液器，加入200微升没有血清的HBSS（如果用可固定的黄色活/死染色标记细胞）或200μlHBSS + 2％ FBS（如果使用7-AAD进行死细胞鉴别）到每个孔中洗涤。吸取上下?3次以重悬细胞。离心该试验在?400×g下再次平板5分钟，并轻轻地离开上清液注意：如果您在测定中使用可固定的黄色活/死染色，请执行步骤19-22，否则跳至步骤23.
4. 根据HBSS准备足够的可固定黄色活/死染色 ?到制造商的协议，使得每孔200μl 的板。简言之，加入50μl所提供的DMSO ?加入到一个小瓶的干燥染料溶液中并混合。这种重构染料溶液在HBSS中稀释1/1000，用于标记
5. 重悬细胞在每个井（不包括CTV只有控制井和未染色的对照孔，图1孔D7-D9和E8） LIVE/DEAD可固定黄色染色/HBSS通过上下吹吸a 多通道移液器。将板在冰上在黑暗中储存30分钟。
6. 在?400×g离心板5分钟，除去上清液，用200μl/孔HBSS + 2％FBS洗涤。
7. 在?400×g离心板5分钟，除去上清液。
8. 继续在板中使用您想要的抗体组进行染色，有或没有Fc阻断步骤。
示例染色
1. 加入30μlFc块混合物到每个实验（非补偿对照）孔（1μlFc封闭抗体原液，29μlHBSS + 2％FBS，最终每孔9.6μgFc嵌段）。吸移上下混合。在RT孵育 5分钟。对于较大的实验，它是方便的做到这一点多通道移液器通过准备鸡尾酒和分发它跨越源96孔板的几个孔。
2. 没有洗涤，每个实验加入30μl表面标志物染色混合物井和移液器上下混合。在室温下孵育?30 min。
  实施例表面染色混合物（每次染色，所有购自eBioscience的Ab）：
  1μlPE抗小鼠CD8a（0.2μg）
  0.25μlPerCP-eFluor 710抗小鼠CD4（0.05μg）
  0.75μlAPC-eFluor 780抗小鼠TCRβ（0.15μg）
  28μlHBSS + 2％FBS
3. 当细胞孵育时，创建单染色补偿对于在使用的流式细胞术实验中使用的每种抗体的对照 Ultracomp eBeads在5ml圆底FACS管中，制造商的协议。
4. 用HBSS + 2％FBS洗涤孔2次。重悬于200微升每孔HBSS + 2％FBS用于分析。如果使用7-AAD 对于死细胞鉴别，重悬所有孔，除了CTV 对照和未染色的对照孔，每孔200μlHBSS + 2％FBS + 1 ?μg/ml 7-AAD。（重悬CTV对照和未染色的对照孔 200μlHBSS + 2％FBS，不含7-AAD。）
5. 流式细胞仪分析。对于每个孔，我们通常从板中移除每孔200μl，转移到含有400μlHBSS + 2％胎牛血清的5ml圆底FACS管中， ?FBS，并加载到细胞仪上进行采集。我们一般分析细胞无固定，但可以固定细胞与?1％甲醛在PBS中分析前如果需要或需要局部流式细胞术设施。请注意，固定不是兼容使用7-AAD进行死细胞鉴别，并将通常破坏GFP ⁺细胞中的GFP荧光。
分析提示和样品数据
我们建议基于正向和侧向散射（FSC/SSC）绘制包含淋巴细胞的门，并且如果需要死亡细胞分化，则选择活细胞（：LIVE/DEAD可固定黄色染色阴性/低人群或7-AAD低人群，分别参见图2A，B）。未刺激的孔将具有清楚的死细胞群体，以帮助绘制死细胞门。然后选择TCRβ⁺，CD4 SP细胞。我们已经注意到，使用抗CD3ε（克隆145-2C11）用于刺激降低了TCRβ的染色强度（使用H57-597克隆），在绘制TCRβ⁺，CD4SP细胞在刺激和未刺激的条件。
接下来，为了分析增殖的程度，检查该门控TCRβ⁺，CTV的CD4 SP群体（图2）。含有Treg（其未用CTV标记）的孔将具有未被CTV染色的TCRβ+细胞群，并且必须从分析中排除 - 使用未染色的样品连同1：1 Treg：Tresp样品（其应当显示低反应者增殖允许容易地描绘Treg与应答者群体），以确定放置包含所有CTV阳性事件的门的阈值（参见图2C，澄清）。人们不能在FoxP3阳性的基础上排除Treg，因为一些Treg可能在测定期间丧失FoxP3表达。然后使用未刺激的样品（即：图1，孔B6-B9）画出包含已增殖至少一次的所有CTV阳性事件的门（图2D）。如果测定已经孵育太长时间，一些大量增殖的细胞可能已经失去足够的染料，变得不能与CTV阴性细胞区分。在这种情况下，我们建议缩短您的测定孵育时间，以避免这个问题。我们能够解决7代细胞分裂，因此我们报告数据为至少增殖一次的第0代至第7代细胞的百分比。如图2E所示，可视地呈现增殖数据也是重要的。

图2.在抑制测定孵育和样品数据之后的Celltrace紫染色分析。A基于使用LIVE/DEAD黄色可定影染色剂或B.7D细胞的阴性/低染色进行分析的门控活细胞的实例。 AAD。 C.检测含有高比例的Treg与应答T细胞的样品促进包含真实CTV标记的应答者的门的放置，并在测定中避免未标记的Treg。 D.来自已经增殖至少一次的0-7代的CTV ⁺细胞的门控的实施例。 E.使用不同比例的Treg与应答T细胞的应答T细胞增殖的程度的视觉比较

笔记

用于这些研究的FoxP3-EGFP菌株（B6.Cg-Foxp3 ^tm2Tch/J）已经被工程化以从编码正常内源的内源foxp3基因座产生双顺反子转录物FoxP3蛋白以及EGFP。由相同的共同的"FoxP3-EGFP"名称提到的另一个菌株在内源性foxp3基因座处代替编码FoxP3-EGFP融合蛋白。这种融合蛋白已经显示具有改变的功能，因此我们不能推荐它的使用。融合蛋白菌株含有由Rudensky集团开发的Foxp3 等位基因，并且以前可通过The Jackson Laboratory获得，尽管它已从其目录中去除。请参阅Chatila和Williams（2012年）及其中的参考资料，以更全面地概述这一问题。
尽管我们不使用这种方法，但是所述测定应当容易使用基于经典CD4 + CD25 + sup/+/CD4 + sup/+细胞的Treg和响应者的纯化， CD25 ^-表面表达表型
我们的设施中使用的流式细胞仪被配置为检测具有450nm/50nm带通滤波器组的Celltrace紫色，以及具有475低通滤波器+ 525nm/50nm带通滤波器组的LIVE/DEAD可固定黄色染色。人们可以替代其他重要的污渍，而不是LIVE/DEAD可固定的黄色染色或7-AAD根据需要可检测与特定的细胞仪配置/要求固定。
代替使用CD4 ⁺ FoxP3 ^-细胞作为反应者，也可以在该测定中代替Celltrace-violet标记的未分级的脾细胞作为反应者细胞。对于这种方法，我们使用每孔2×10 5个标记的脾细胞作为应答者，并省略将Rag KO脾细胞作为APC添加。

食谱

富含DMEM（E-DMEM）
10％胎牛血清 1％Pen/strep（100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素） 1％非必需氨基酸
1％丙酮酸钠 2mM L-谷氨酰胺 50μM2-巯基乙醇
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
137 mM NaCl 2.7 mM KCl
10mM Na 2 HPO 4
1.8mM KH 2 PO 4 sub/
ACK裂解缓冲液
15.5mM NH 4 Cl
1mM KHCO 3
0.01mM EDTA

致谢

作者感谢Perveen Anwar对动物护理的援助。本文所述的所有动物工作根据在Alberta大学批准的动物护理方案进行。这项工作得到CIHR（FRN79521）授予CCA和阿尔伯塔糖尿病研究所的博士生奖学金和艾伯塔省创新健康解决方案（AIHS）授予KKE以及AIHS至CCA的高级学者奖。这项工作还得到了来自加拿大多发性硬化症协会和多发性硬化症科学研究基金会的endMS地区研究和培训中心研究生支持资助。

参考文献

Chatila，T.A。和Williams，C.B。（2012）。 Foxp3：宽容的阴影。免疫力 36（5 ）：693-694。
Ellestad，K.K.，Thangavelu，G.，Ewen，C.L.，Boon，L.and Anderson，C.C。（2014）。 PD-1不是天然或外周诱导的调节性T细胞所必需的：严重的自身免疫，尽管正常生产调节性T细胞。 Eur J Immunol 44（12）：3560-3572。
Kruisbeek，A.M.，Shevach，E。和Thornton，A.M。（2004）。 T细胞功能的增殖测定。 Curr Protoc Immunol 第3章：第3单元12.
Rudensky，A.Y。（2011）。 Regulatory T cells and Foxp3。 Immunol Rev 241（ 1）：260-268。