材料和试剂

注射器10ml（BD bioscience，目录号：309604）
Needle 22G（BD bioscience，目录号：305155）
注射器1ml 27G（BD bioscience，目录号：309623）
15ml离心管（Thermo Fisher Scientific，目录号：339651）
50ml离心管（Thermo Fisher Scientific，目录号：339653）
96孔V型孔板（Thermo Fisher Scientific，目录号：249662）
5ml聚苯乙烯FACS管（BD Biosciences，Falcon ，目录号：352054）
70μm尼龙过滤器（VWR International，目录号：352350）
小鼠
PBS（不含Ca 2+ 2 + /Mg ^{2 +}（BOLLéCOMMUNICATIONS，Wisent，目录号：311-010-CL）
不含Ca 2+/Mg 2+/Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（Sigma-Aldrich，目录号：D8537）的冰冷Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（DPBS）
PBS 10x，不含Ca 2+ 2 + /Mg ^{2 +}（BOLLéCOMMUNICATIONS，Wisent，目录号：311-012-CL）
Nα-甲苯磺酰基-L-赖氨酸氯甲基酮盐酸盐（TLCK）（Sigma-Aldrich，目录号：T7254）
Liberase TL研究级（Roche Diagnostics，目录号：05401020001）
DNAse1（Roche Diagnostics，目录号：11284932001）
HEPES（1M）（Sigma-Aldrich，目录号：H0887）
胎牛血清（FBS）（Sigma-Aldrich，目录号：F1051）
EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：E16144）
Percoll（GE Healthcare，Dharmacon，目录号：17-0891-01）
（BOLLéCOMMUNICATIONS，Wisent，目录号：311-506-CL）的HBSS 10x，其中含有Ca 2+ 2+ /Mg ^{2 +}
（Life technologies，目录号：14170-112）的HBSS，不含Ca 2+/Mg 2+/H 2 SO 4 + 注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：14170-112"。
纯化的大鼠抗小鼠CD16/CD32（BD Bioscience，目录号：553141）
抗小鼠CD45 PE/Cy5（BD Bioscience，目录号：553082）
抗小鼠CD11b Alexa 700（eBioscience，目录号：56-0112-82）
抗小鼠CD16/CD32（1:100）（BD Biosciences，目录号：553142）
活/死可固定蓝色死细胞（生命技术，目录号：L23105）
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^TM ，目录号：L23105" br />
消化介质（参见配方）
冰冷的FACS缓冲液（参见配方）
Percoll稀释介质（参见配方）
PFA 4％（w/v）溶液（参见配方）

设备

组织研磨机容量3ml（VWR International，目录号：886000-0020）
离心Sorvall图例RT（Mandel，目录号：75004377）
流式细胞仪BD Canto II或LSR II（BD bioscience）
蠕动泵，兼性（Cole-Parmer Instrument Company，目录号：EW-78001-02）

软件

BD FACS Diva软件（版本6.1.2）

程序

阶段1：动物准备和灌注
1. 通过腹腔麻醉小鼠。注射氯胺酮盐酸盐和甲苯噻嗪混合物（分别为10ml和1ml）
2. 用冰冷的无菌DPBS（灌注。）冲洗深度麻醉的小鼠用冷的dPBS使用蠕动泵或10ml注射器经心脏连接22G针。许多很好描述的协议可用在线，但好的例子见参考文献视频1和视频2。
阶段2：脑提取和小胶质细胞的分离
1. 提取一个脑，并将脑组织放入含有2ml没有Ca 2+ 2 + /Mg ^{2 +}的冰冷DPBS的组织研磨机中。
2. 匀浆后，将匀浆转移至15ml离心 ?管（通过与上下同时完成组织匀浆）研磨棒）。
3. 用2ml冰冷的DPBS冲洗柱塞三次。保持冰上。
4. 在4℃下以300×g离心匀浆10分钟。
5. 吸出上清液，轻轻地将沉淀重悬于3ml消化培养基中
6. 孵育匀浆在37℃下40分钟，摇动管每10分钟
7. 消化后，用冰冷的FACS缓冲液将体积完全加至10ml
8. 通过70微米尼龙过滤器过滤细胞悬浮液，将匀浆转移到新的50ml离心管中
9. 洗涤细胞通过冲洗15毫升离心管用10毫升冰冷的FACS缓冲液，并转移到50ml离心管中通过相同的70μm过滤器
10. 在4℃下以300×g离心匀浆10分钟。
11. 吸出上清液，加入20ml冰冷的FACS缓冲液洗涤细胞
12. 在4℃下再次离心匀浆，在300×g离心10分钟
13. 在离心期间，制备等渗的Percoll溶液通过在10x HBSS中稀释Percoll 10：1。准备所需体积的30％和 80％Percoll溶液，用Percoll等渗溶液稀释 ?Percoll稀释介质。
  注意：保持Percoll溶液在室温下。
14. 将细胞沉淀重悬于8ml 30％Percoll溶液中
15. 将4 ml转移到15 ml离心管中。
16. 使用血清移液管，小心转移3毫升80％Percoll ?溶液在含有4ml 30％Percoll溶液的细胞下面注意：在血清学移液管中取4-5 ml，并使用重力作用于底层 ?80％Percoll溶液避免上下混合层，这可能影响小胶质细胞的效率和产量隔离。
17. 将剩余的含有30％Percoll溶液的细胞加入上层相
18. 以1,050 x g 离心，无制动器，在室温下低加速40分钟。
19. 吸出液体顶部的含脂肪层。
20. 使用P1000微量移液管，仔细收集分离的小胶质细胞（约2ml）转移到含有10ml的新的15ml离心管中冰冷的FACS缓冲液注意：小胶质细胞在细胞内环在粉红色顶层（30％Percoll）和无色底层（80％Percoll）。
21. 在室温下将分离的小胶质细胞在300×g离心10分钟
22. 吸出上清液，并将沉淀的细胞重悬在250μl冰冷的FACS缓冲液中。
  
  图1.梯度准备的示意图
阶段3：小神经胶质细胞标记染色和流式细胞术
1. 将所有细胞悬浮液（250μl）转移到96v形孔板中
2. 在4℃下以300×g离心细胞3分钟，并通过倒置平板除去上清液。
3. 将细胞重悬于200μl冰冷的FACS缓冲液中纯化的大鼠抗小鼠CD16/CD32（1:100）用于Fc受体阻断
4. 在冰上孵育20分钟。
5. 在4℃下以300×g离心细胞3分钟，除去上清液。
6. 将细胞重悬在50μl含有大鼠的冰冷的FACS缓冲液中抗小鼠CD45 PEG/Cy5（1:50），大鼠抗小鼠CD11b Alexa 700（1:50）和活/死蓝荧光活性染料（1:50）
7. 在冰上孵育45分钟。
8. 加入200μl冰冷的FACS缓冲液注意：在这一步，可以修复后续的单元格在流式细胞仪上通过加入50μl的4％（w/v）多聚甲醛（PFA）溶液。在室温下孵育温度15分钟，然后用冰冷的FACS缓冲液洗涤细胞 ?它们在4℃下在黑暗中储存最多4天。
9. 在4℃下以300×g离心细胞3分钟。
10. 将细胞重悬在250μl冰冷的FACS缓冲液中，并转移到5ml聚苯乙烯管中进行流式细胞术。
11. 使用双激光六色FACS Canto II流分析样品 ?细胞仪和数据采集与BD FACSDiva软件（版本 6.1.2）。

代表数据

图2.通过流式细胞术分析分离的小胶质细胞后的结果的实施例点图显示了在活/死蓝，CD45-PE-标记后，通过流式细胞术分析的分离的小胶质细胞的代表性样品。 Cy5和CD11b-AF700免疫荧光染色。

食谱

消化介质
TLCK0.5μg/ml
DNAse1 25ng/ml
Liberase 8.125pg/ml
HEPES 20mM
在无菌水中
冰冷的FACS缓冲区
5％FBS，EDTA（20mM），HEPES（2mM）稀释于PBS中
Percoll稀释介质
红色酚HBSS与EDTA（2mM）和HEPES（20mM）
PFA 4％（w/v）溶液（pH = 7.4） NaOH（50mN）4％（w/v）多聚甲醛
50 mN NaOH
26.5mM NaH 2 PO 4 4/v/v 77mM Na 2 HPO 4
（77mM）

致谢

这项工作得到加拿大健康研究所（CIHR）和加拿大多发性硬化症科学研究基金会的资助。该协议改编自Martine Lessard和Antoine Lampron的以前的工作。

参考文献

Lampron，A.，Larochelle，A.，Laflamme，N.，Prefontaine，P.，Plante，M.M.，Sanchez，M.G.，Yong，V.W.，Stys，P.K.，Tremblay，M.E.and Rivest，小胶质细胞对髓磷脂碎片的无效清除损害了髓鞘再生过程。 J Exp Med 212（4）：481-495。
视频1： www.youtube.com/watch?v=szvmT5iI0z0 。
视频2： www.youtube.com/watch?v=3H8K7ooPWLs 。