材料和试剂

塑料巴斯德移液管（Corning，Falcon ，目录号：357575）
30微米孔的尼龙布
90毫米Whatman圆形滤镜尺寸
白色滤纸（GE Healthcare，目录号：10347009）
Fleler过滤单元（Cole Parmer流体处理和分析项目）（Cole-Parmer Instrument Compan，目录号：EW-08917-50）
一次性培养皿（Kord-Valmark Labware Products，目录号：2900）
堆肥土
大豆种子（William 82或Essex）（大豆）（ARS-USDA）
次氯酸钠（商业Bleach-Clorox含有8.3％高氯酸钠）
蔗糖（Baker Analyzed Reagent，目录号：4072-1）
表糖（商业糖）
乙醇（Warner-Graham公司，目录号：64-17-5）
注意：目前，它是"Sigma-Aldrich，目录号：64-17-5"。
硫酸锌七水合物（Sigma-Aldrich，目录号：91f-0135）
蔗糖溶液（见配方）
次氯酸钠溶液（见配方）
3毫米的硫酸锌七水合物（ZnSO 4）溶液（参见配方）

设备

温室有一个水槽，将排水转移到一个氯容器，以杀死线虫下来的线虫
8-10英寸圆盆（梅尔斯草坪花园）
筛（筛尺寸：＃20 = 841微米;＃60 = 250微米;＃80 = 177微米;＃100 = 149微米;＃250 = 58微米;＃500 = 25微米）（美国标准筛系列） >
1升玻璃圆筒（Pyrex USA）
解剖显微镜（Spenser）
Gyrotory水浴摇床（LabX，New Brunswick Scientific，型号：G76）
1升玻璃烧杯（Pyrex）
平台振动器（New Brunswick Scientific）
10ml的移液管（Thermo Fisher Scientific，Fisherbrand）

程序

注意：所有程序必须符合APHIS要求，以防止线虫逃离实验室和温室。

将含有用SCN接种的大豆植物的培养罐保持三个月或更长时间。为了从储存罐收集孢囊，在来自接种SCN的储存罐的大豆植物的土壤线处切断茎3个月。将根和土壤的球放入含有水的两加仑桶中以从土壤球中松开根系统（图1）。如何制作大豆胞囊线虫培养罐在Matthews等人（2013）中有描述。

图1.含有用大豆胞囊线虫接种的大豆植物的培养罐

图2. A.含有SCN的大豆根。（箭头表示线虫胞囊）
将根置于嵌套的筛子上，在顶部＃20和在底部＃100，如图3所示。用手指轻轻按摩根并在流水下漂洗以收集在＃100筛上的孢囊和雌性。

图3.嵌套筛网，＃20在顶部，＃100在底部
通过用流水轻轻洗涤筛子的内部，在筛子的边缘收集囊肿。含水孢囊聚集在筛子的边缘。将孢囊迅速倒入无菌的500ml塑料烧杯中。
通过用棒搅拌，将保留在桶中的土壤 - 水混合物中的孢囊与土壤分离。将水倒入嵌套的筛中，在顶部＃20和在底部＃100，并且在＃100筛上收集孢囊和雌性。将该步骤重复4?5次。
注意：高压灭菌土壤和根系废物。用10％漂白溶液处理桶以杀死任何剩余的线虫。我们在水槽排水管中有一个阀门，用于将含有线虫的水转移到一个用氯处理废水的储水槽中。
将含有孢囊和雌性的水倒入1L玻璃圆筒中。 20到30分钟后，雌性和囊肿沉积到圆柱体的底部。
使女性和土壤沉降5-10分钟，并倒出尽可能多的水。加入蔗糖溶液至终体积为500ml。将一片石蜡膜放置在圆筒的顶部上并颠倒两次以混合溶液。在15分钟内，雌性和囊肿浮在溶液的顶部，将它们与大多数土壤颗粒和根碎片分离，如图4所示。

图4.雌性和囊肿漂浮在蔗糖溶液的顶部，将它们与大多数土壤颗粒和根碎片分离（箭头指向雌性和囊肿）

注意：在等待雌性沉降的同时制备蔗糖溶液（454克/L），因此其是新鲜的以避免真菌生长。表糖工作正常。
为了进一步清洁雌性和囊肿，将它们倒入1L玻璃烧杯中。在倾倒的同时旋转圆柱体以回收粘在圆柱体壁上的雌性。将来自烧杯的溶液倒入3英寸直径的＃100筛中并充分漂洗以除去蔗糖溶液。冲洗筛并将内容物收集在250ml烧杯中。
为了从任何剩余的根碎片清洁女性，旋转烧杯以重悬雌性和囊肿并允许沉降几秒钟。女性和囊肿被允许下沉到烧杯的底部，因为它们比大多数根碎片更重。通过将水倒入玻璃烧杯中弃去根碎片，在烧杯底部留下雌性和囊肿。该步骤重复几次，直到大部分根碎片被除去。
为了从囊肿释放线虫和卵，在高压灭菌4cm深的塑料板（移液管吸头盒的盖子）的顶部放置含有雌性的100筛。添加无菌水到刚好高于筛子的水平。轻轻地粉碎女性和囊肿用干净的橡胶塞。偶尔提起筛子，让鸡蛋掉落到下面的盖子。粉碎女性和囊肿5至10分钟。当水混浊时，将筛子转移到新的灭菌的ddH 2 O的高压灭菌的4cm深的塑料板（移液管尖端盒的盖子）上。再次粉碎。检查在显微镜下女性的压碎的进展。当完成粉碎时，将溶液倾倒通过用＃500筛网嵌套的3英寸直径＃250。＃250筛子捕获女性和囊肿壳。＃500筛包含纯化的蛋，而小碎片流过＃500筛。

图5.将雌性和囊肿放置在高压灭菌的350ml板的顶部以释放蛋
通过将具有蛋的＃500筛子置于高压灭菌的4cm深的塑料板（移液管吸头盒的盖子）中来灭菌鸡蛋。向蛋中加入漂白溶液1.5分钟，旋转筛子。将蛋排干并用1L无菌水冲洗。将少量无菌水加入蛋中，并将蛋倒入新鲜无菌的4cm深的塑料板（移液管吸头盒的盖子）中。用无菌水使蛋和无菌水混合物的体积达到120ml。然后，加入1.2ml无菌的300mM ZnSO 4·7H 2 O·7H 2 O（硫酸锌七水合物），使最终浓度为3mM ZnSO 4 ₄。 ZnSO 4增强孵化并控制真菌生长。用塑料包膜覆盖板，并置于28℃，50-75rpm的加热振荡器上通气至少三天。其后每天继续孵蛋超过一周。使用解剖显微镜监测孵化的进展。孵化线虫如图6所示。

图6. Hached J2幼虫线虫和卵
通过将30微米孔径的干净的尼龙布置于含有200ml反渗透水的1L玻璃烧杯中收集J2阶段幼体。将蛋/幼体溶液倒入尼龙布中并收集。布像一个茶包浸入水中几分钟。如果幼鱼非常浓缩，用新鲜的烧杯和水重复该过程。在1L烧杯中将体积增加至不超过200ml，然后以50-75rpm置于振荡器上以将幼体集中到烧杯的中心。大约半小时后，用巴斯德吸管取出J2幼体，并置于400ml烧杯中。加入无菌水至实验所需的体积，并通过在显微镜载玻片上的一滴水上吸取5μlJ2溶液以计数线虫来检查浓度。将其重复三次，并计算平均值。为了每毫升1000个J2，你需要5个每5μl溶液的J2。
为了接种大豆植物的根，将植物在无菌砂中生长4周。在接种之前，将植物浇水，然后排出以保持它们水合。在植物两侧的沙子上制出两个深约1.5至2厘米深，距离茎0.5至1厘米的孔。在接种期间使线虫溶液轻轻地涡旋以保持线虫均匀悬浮并充气。使用10ml移液管测量和分配J2线虫的溶液。向每个孔中加入1ml的1,000J2/ml溶液，总共为2,000J2 /植物。孔里轻轻地充满了沙子。植物不浇水两天，以使幼体有机会发现并迁移到根中。
在30-35天后，如步骤2和3中所述从每个植物收获雌性。将含有具有线虫的大豆根的沙球轻轻地放置在1L塑料烧杯中。通过在烧杯上轻轻按摩根部来除去大部分沙。保留含有水和砂的烧杯用于收集孢囊和雌性。冲洗细胞堆叠或盆，并收集溶液以获得可能粘附到壁的雌性。将含有囊肿和雌性的溶液倒入另一个中并进行标记。在流水下轻轻擦拭根部以将囊肿和雌性移到一对嵌套的筛子上。＃20筛允许囊肿通过，同时保持更大的碎片。囊肿和雌性保留在＃100筛上。将囊肿和雌性倒入干净的标记烧杯中。通过使水通过嵌套的筛子来收集在沙子和用于冲洗罐壁的水中的囊和雌。将更多的水加入到烧杯中并旋动以释放陷入沙子中的囊肿和雌性。使水通过筛子。冲洗砂以获得囊肿和雌性的这个过程重复三次或直到旋转后水清澈。将根保存在标记的100ml塑料烧杯中用于干重测量
使用Fleaker过滤单元（图7）在衬有90mm Whatman过滤器圆上收集孢囊。加入水以润湿过滤器。在真空下加入收集的线虫溶液。从单元中取出过滤器，并将盖放置在一次性标准Petri板上。在解剖显微镜下计数囊肿。每个根的干重记录在电子表格中。

图7.在内衬的Whatman滤纸上收集的SCN囊肿
女性指数计算。使用Grubbs检验去除雌性计数数据中的异常值（Grubbs，1969）。可以在GraphPad QuickCalcs网站上找到免费在线版本（ http://graphpad.com/quickcalcs/grubbs1/）。使用Shapiro-Wilk检验检查数据的正态性（Shapiro和Wilk，1965）。由S. Ditamin执行的免费在线版本可在 http://dittami.gmxhome.de/shapiro/）。雌性指数可以如下计算：雌性指数=（N g g/N c）×100，其中N g g =平均雌性对实验植物的根。 N c c =存在于对照植物的根上的雌性的平均数。可以使用Welch的不成对的 t 测试比较不平等方差的平均值（Welch，1947）。可以在GraphPad QuickCalcs网站上免费获得版本（ http://graphpad.com/quickcalcs/ttest1/）。可以计算每根根干重的孢囊数，以使实验标准化，特别是如果根大小变化很大。

食谱

1L蔗糖溶液 454克蔗糖 1 L反渗透水
次氯酸钠溶液
通过向285.2ml无菌水中加入14.8ml标准漂白剂（8.3％次氯酸钠）制备0.4％次氯酸钠溶液。
3mm的硫酸锌七水合物（ZnSO 4）溶液
1.2ml无菌的300mM ZnSO 4·7H 2 O（硫酸锌七水合物），使最终浓度为3mm ZnSO 4

致谢

该协议改编自我们以前的工作，包括Matthews等人（2013）和Youssef等人（2013）。我们感谢Peggy MacDonald的技术支持。提及商业名称，专利产品或供应商不构成美国农业部对产品的担保或保证，也不意味着批准其他可能适用的其他产品或供应商。作者没有利益冲突。

参考文献

Grubbs，F。（1969）。在样本中检测异常观察的程序。 Technometrics 11：1-21。
Matthews，B.F.，Beard，H.，MacDonald，M.H.，Kabir，S.，Youssef，R.M.，Hosseini，P.and Brewer，E。通过对大豆中100种基因对其主要病原体，大豆胞囊的功能代谢研究的工程化抗性和过敏性线虫。 237（5）：1337-1357。
Matthews，B.F.，Beard，H.，Brewer，E.，Kabir，S.，MacDonald，M.H.and Youssef，R.M。（2014）。拟南芥基因， AtNPR1 ， > AtTGA2和 AtPR-5 ，当在转基因大豆根中过表达时赋予对大豆胞囊线虫（ Heterodera glycines ）的部分抗性。 BMC Plant Biol 14：96.
Shapiro，S.S。和Wilk，M.B。（1965）。正常模型的方差测试分析（完整示例）。 Biometrika 52：591-611。
Youssef，R.M.，MacDonald，M.H.，Brewer，E.P.，Bauchan，G.R.，Kim，K.H。和Matthews，B.F。（2013）。 AtPAD4的异位表达拓宽了大豆对大豆胞囊和根结线虫的抗性。 BMC Plant Biol 13：67.