材料和试剂

用于透射电子显微镜的网格（Sigma-Aldrich，目录号：G5526）
200μl离心管（Eppendorf或其他品牌）
1.5 ml离心管（Eppendorf或其他品牌）
50 ml离心管（Eppendorf或其他品牌）
0.22μm微孔过滤器单元（Merck Millipore Corporation）
植物根尖（切成?2 mm大小）
25％戊二醛（Sigma-Aldrich，目录号：G6257）
磷酸氢二钠十二水合物（Na 2 HPO 4）（Sinopharm Chemical Reagent Co.，目录号：10039-32-4）
高锑酸钾（PPA）（Sigma-Aldrich，目录号：60500）
1M NaOH（Sinopharm Chemical Reagent Co.，目录号：10019718）
丙酮（100％）（Sigma-Aldrich，目录号：69508）
乙醇（100％）（Sinopharm Chemical Reagent Co.，目录号：100092690）
乙二醇-O，O'-双（2-氨基乙基）-1 N，N，N'，N'-四乙酸（EGTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E3889）
1M HCl（Sinopharm Chemical Reagent Co.，目录号：10011061）
Epon 812（Sigma-Aldrich，目录号：45346）
Formvar溶液（Sigma-Aldrich，目录号：09823）

设备

冰箱（4°C）
孵化器
真空设备（真空泵连接到干燥器）
pH计
透射电子显微镜（Hitachi High-Technologies Europe GmbH，型号：H-7500）
超微切片机（Leica Microsystems，型号：EM UC6）
镊子（尖头）
玻璃烧杯
玻璃搅拌棒

程序

制备PPA染色溶液
1. 制备4％PPA溶液：溶解8.0g焦磷酸钾（PPA） ?通过加热至90-95℃并且连续地加入400mM Na 2 HPO 4（pH 7.6）搅动。然后，通过0.22μmMillipore过滤溶液过滤器，然后在使用前保存在4°C冰箱中（见注1）
2. 制备PPA染色液（50ml）：混合25ml 4％PPA溶液与6 ml 25％戊二醛，然后用19ml无菌H 2 O填充（参见注释 ?2）。
固定和漂洗：收集生长在1/2 MS培养基上的植物根尖，并用蒸馏水冲洗数次，然后用尺寸为约2mm的手术刀切割裂口尖端，并迅速将其置于1.5ml离心机中的冷PPA染色液中管。如果植物材料漂浮，进行真空处理（0.8Mpa，10分钟），直到材料沉到管的底部，在4℃固定，过夜。弃去PPA染色液，用1％PPA溶液冲洗3次，每次5分钟
脱水：然后，将固定材料在分级的冷丙酮系列（30％，50％，70％，90％，100％，100％）中脱水，每次15分钟。
渗透：脱水后，用Epon 812：纯丙酮（1：3,1：1和3：1）的系列混合物处理材料，每次12小时;和纯Epon 812混合物（35-40℃）12小时
嵌入：添加新鲜的Epon 812混合物以清洁200微升eppendorf管，小心地转移根尖，组织根尖，并让其合并在包埋混合物中，但不能用针接触管壁（图1A）。然后将管置于培养箱中，35℃12小时，然后45℃12小时和60℃24小时，直到树脂良好固化。在室温下冷却约1小时。
涂层镍网：可以通过将网格在formvar溶液中合并几秒钟，然后在滤纸上干燥约1至2小时来完成具有formvar的涂层镍网格;或将一滴formvar溶液直接放在干净的草坪上的镍网上，然后让其自然干燥，约需2小时。
切片：在用锋利的刀（或块修剪器）适当地修剪嵌入块之后，用超切片切片机切割该块以产生100nm厚的超薄切片，并安装到200目的形成有镀层的镍网上（图1B）。在灯下干燥约1小时。
显微镜：用透射电子显微镜检查样品。钙沉积显示黑色颗粒或聚集体（图1C-D;注释3）

图1.苜蓿根尖细胞中的取样和钙沉积的代表性模式。 A.嵌入混合物中样品的图示; B.镍网格样品截面图。 C. rstB 转基因苜蓿的皮层细胞壁显示大的聚集物沉积在膜和细胞质的残余物上。 wt植物的表皮细胞壁显示弱的钙染色。沉积的颗粒较小。用固体红色箭头指示钙沉积。脂质体（液滴）用蓝色虚线箭头表示。刻度条代表2μm。

笔记

对于植物细胞固定，戊二醛的浓度可以为2.5％-4％。在该方案中，使用3.0％Glutaraldehye
对于钙染色，在不同方案中PPA浓度可以为0.5％至2.5％
为了证实所观察到的颗粒是钙沉积物，可以在60℃下用0.1M EGTA（pH 8.0）处理切片30分钟，然后再次检查。钙颗粒可以通过EGTA处理除去（Stockwell和Hanchey，1982）

食谱

1 H Na 2 HPO 4（pH 7.6）在1L水中溶解138g NaH 2 PO 4 PO 4，H 2 H 2 O并溶解142g Na 2 SO 4，在1L水中制备它们的1M储备溶液。
HPO 在此期间，用NaOH或HCl测试并改变pH值至7.6
400mM Na 2 HPO 4（pH 7.6）
将338ml 1M Na 2 HPO 4和62ml 1M NaH 2 PO 4溶液混合，并加入水至最终1 L
200mM Na 2 HPO 4（pH 7.6）
用等体积的蒸馏水稀释400mM Na 2 HPO 4水溶液
4％PPA溶液
在发烟窗中，通过加热至90-95℃并在连续搅拌下将8.0g焦锑酸钾（PPA）溶解在400mM Na 2 HPO 4（pH 7.6）中。
PPA染色液（50ml）将4％PPA溶液25ml，25％戊二醛6ml和19ml无菌H 2 O混合物混合
0.1 M EGTA
在约80ml水中加入18.61g EGTA，2.0g NaOH，继续搅拌直至完全溶解
加水至100 ml
将pH值调整为8.0
1 M NaOH
将4.0g NaOH溶于100ml水中
1 M HCl
取8.36ml 37％HCl，加水至100ml

致谢

该方案是来自Stockwell和Hanchey（1982）和Borgers等人（1982）的改编。这项工作得到了中国国家自然科学基金（31472140）的支持。我们感谢Hao女士在钙定位测试中的技术援助。

参考文献

Borgers，M.，Thone，F.，Verheyen，A.and Ter Keurs，H.E。（1984）。钙在骨骼和心肌中的定位。 Histochem J 16（3）：295-309。
Stockwell，V.and Hanchey，P。（1982）。钙定位的细胞组织化学技术及其在病变植物中的应用植物生理 70（1）：244-251。
Wick，S.M。和Hepler，P.K。（1982）。使用锑酸钾选择性定位细胞内Ca 2+ 2 + 。 J Histochem Cytochem 30（11）：1190-1204。
Zhang，W. J.和Wang，T。（2015）。通过rstB基因转化提高苜蓿（苜蓿）的耐盐性。 Plant Sci 234：110-118。