材料和试剂

HEK293细胞
聚dL-鸟氨酸（PLO）（Sigma-Aldrich，目录号：P8638）
硼酸（Sigma-Aldrich，目录号：B0394）
磺基-NHS-SS-生物素溶液（Thermo Fisher Scientific，Pierce Antibodies，目录号：21331）
Neuroavidin珠（Thermo Fisher Scientific，Pierce Antibodies，目录号：29200）
EDTA·2H 2 O（MW 372.2）（Sigma-Aldrich，目录号：E1644）
EGTA·2H 2 O（MW 380.4）（Sigma-Aldrich，目录号：E4378）
NaPyrophophate（Sigma-Aldrich，目录号：S9515）
NaF（Sigma-Aldrich，目录号：S7920）
（MW-446.1）（Sigma-Aldrich，目录号：5-9515）。< br /><
蛋白酶抑制剂（F.Hoffmann-La Roche，目录号：1873580）
NaVO ₃
NaOH
PBS
CaCl <2>
MgCl 2
甘氨酸
Triton
HCl
4x加载缓冲区
生物素淬灭溶液（参见配方）
PBS/CaCl 2 2/MgCl 2 2（参见配方）
IP缓冲区（参见配方）
库存（见配方）

设备

0.22μm过滤器
12孔板
Western印迹设备

程序

制备PLO溶液：将90mg PLO加入180ml硼酸盐缓冲液（将1.668g硼酸溶解在180ml H 2 O中，并用NaOH调节pH至8.3），并通过0.22μm过滤器过滤灭菌。
将12孔板用PLO溶液在室温下在培养罩中过夜（1ml /孔）。在细胞接种前第二天用无菌水清洗三次。
将HEK293细胞置于聚鸟氨酸包被的12孔板上，并根据需要进行转染
在细胞收获的当天，在0.5mg/ml的PBS/CaCl 2/MgCl 2溶液中溶解Sulfo-NHS-SS-生物素。并存储在冰上
用1ml冰冷的PBS/CaCl 2/MgCl 2洗涤细胞两次。
生物素化
1. 加入0.3ml 0.5mg/ml Sulfo-NHS-SS-生物素溶液
2. 在冰上孵育30分钟，偶尔摇动
用冰冷的淬灭溶液洗涤三次，并在每次除去溶液前孵育5分钟，以中和未交联的试剂。
用120μlIP缓冲液溶解细胞，并在冰上孵育10分钟
将每个孔的所有内容物转移到1.5ml管中，并在4℃台式离心机上以Vmax（约14,000rpm）旋转10分钟。
保存10μl上清液（加入10μl4x加样缓冲液）作为供应将100μl上清液与50μl固定化中性链亲和素的50％浆液混合，并在4℃下旋转2-3小时。
在4℃离心机中以5,000rpm旋转1分钟。除去上清液，用1ml IP缓冲液通过在4℃室中旋转混合物5分钟洗涤珠子。共洗涤三次。
最后一次洗涤后，取出上清液，加入25μl4x上样缓冲液的珠子。充分混合并将管置于65℃水浴中10分钟以使蛋白质变性（选择65℃，因为我们发现在沸水中，许多膜蛋白形成聚集体，这导致蛋白质迁移到丙烯酰胺凝胶中的失败）。加载10μl的蛋白质印迹分析

食谱

生物素淬灭溶液（pH7.4） 50mM甘氨酸（0.1877g）的50ml PBS/CaCl 2/MgCl 2溶液/
PBS/CaCl 2/MgCl 2
PBS（+ 2.5mM CaCl 2，1mM MgCl 2，pH7.4）中的至少一种。

IP缓冲液（pH 7.4）

PBS		50 ml
EDTA	5 mM	0.5ml×0.5M（pH7.4）
EGTA	5 mM	0.5ml×0.5M（pH7.4）
NaPyrophophate	10 mM	0.223克
NaF	50 mM	0.1 g
NaVO ₃	1 mM	0.5ml×100mM

1％Triton
1片蛋白酶抑制剂

股票
1. 0.5M EDTA（pH7.4） 93.05g EDTA·2H 2 O·h/v 500ml ddH 2 O
  加入NaOH直至EDTA溶解，加入HCl调节pH至7.4
2. 0.5 M EGTA（pH 7.4）
  95.1g EGTA·2H 2 O·
  500ml ddH 2 O
  加入NaOH直至EDTA溶解，加入HCl调节pH至7.4
3. 100mM Na 3+ VO 4
  1.84g Na 3+ VO 4+ 10 H 2 O O 2/加入HCl至pH小于10（黄色溶液）。将溶液煮沸至澄清无色。
4. 10ml等分试样并在-20℃下冷冻

致谢

该协议以前在Huang等人（2006）中使用并改编自Huang等人。

参考文献

Huang，G.N.，Zeng，W.，Kim，J.Y.，Yuan，J.P.，Han，L.，Muallem，S.and Worley，P.F。（2006）。 STIM1羧基末端激活天然SOC，I（crac）和TRPC1通道。 < et al。Nat Cell Biol 8（9）：1003-1010。