材料和试剂

抗CD3 Armernian仓鼠一抗（BD Biosciences，目录号：553057，NA/LE）
山羊抗阿默生仓鼠IgG抗体（Jackson ImmunoResearch，目录号：127-005-099）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
CaCl <2>
MgCl 2
DMSO（Merck KGaA，Calbiochem ，目录号：540025）
DMSO中的Fluo-3AM（Life Technologies，Molecular Probes ，目录号：F-1242）
（注意：Fluo-3荧光是钙依赖的）（参见配方）
Fura Red AM在DMSO中（Life Technologies，Molecular Probes ，目录号：F-3020）（注意：Fura Red荧光是钙非依赖性的，Fura Red用作染料加载的对照效率）（参见配方）
在DMSO中的Pluronic F-127（Life Technologies，Molecular Probes ，目录号：F-1242）（参见配方）
Hanks缓冲溶液（HBSS）（Life Technologies，Gibco ，目录号：14170-112）（参见Recipes）
染料加载缓冲液（参见配方）

设备

程序

准备一个样品的染料加样缓冲液2ml
将细胞以5×10 6个细胞/ml悬浮于1ml染色上样缓冲液中，并在37℃下孵育30分钟。
以1,000 rpm速度旋转细胞5分钟。
在冰上或在4℃下用5μg/ml抗CD3仓鼠一抗（无叠氮化物）染色细胞30分钟（0.5μg/100μlPBS）。
洗涤细胞一次。
在3ml HBSS/Ca/Mg/FBS中以3×10 6个细胞/ml重悬细胞，并在室温下保存并避光。
对于钙动员，将样品在37℃预热5-10分钟。提交样品到流式细胞仪进行钙基线测量。 5分钟后，加入5μg/ml山羊抗仓鼠IgG抗体（15μg/3ml），充分混合，立即用流式细胞仪继续测量。为了保持培养温度，在测量的时间过程中，需要一个装有预热到37℃的水的小烧杯来洗涤样品管。

食谱

致谢

该方案以前用于和改编自Huang等人（2008）。

参考文献

Huang，GN，Huso，DL，Bouyain，S.，Tu，J.，McCorkell，KA，May，MJ，Zhu，Y.，Lutz，M.，Collins，S.，Dehoff，M.，Kang，，Whartenby，K.，Powell，J.，Leahy，D。和Worley，PF（2008）。 NFAT通过胞质支架Homer蛋白结合和调节T细胞活化。 Science 319（5862）：476-481。