材料和试剂

高兴包装（微波保险箱，Capri）
Kimwipe（Kimtech Science * Kimwipes精致任务擦拭器）（Kimberly-Clark，目录号：34133）
凝胶盒（尺寸为100mm×100mm，1mm间隙）（Invitrogen，目录号：NC2010）注意：目前，它是"Thermo Fisher Scientific，Novex?，目录号：NC2010"。
15ml蓝帽Falcon管（无菌）（Thermo Fisher Scientific）
Epipestle（bioWORLD，目录号：42741000-1）
96孔UV微孔板（平底）（Thermo Fisher Scientific，目录号：8404）
比色杯（塑料）（SARSTEDT AG& Co，目录号：67.746）
MilliQ水
70％乙醇（Chem Supply，目录号：64-17-5）
2％琼脂糖（Progen，目录号：200-0011）
三（2-氨基-2-羟甲基 - 丙烷-1,3-二醇）（VWR International，目录号：103157P）
来自牡蛎的糖原（Sigma-Aldrich，目录号：G8751）
丙烯酰胺（40％丙烯酰胺/Bis溶液，37.5:1）（Bio-Rad Laboratories，目录号：161-0148）
TEMED（四甲基乙二胺）（AMRESCO，目录号：0761-25ML）
APS（过硫酸铵）（Sigma-Aldrich，目录号：A-7460）
Coomassie Plus Protein Assay Reagent（Thermo Fisher Scientific，目录号：1856210）
牛血清白蛋白（BSA）（冻干，Reagent Grad，pH 7）（Moregate Biotech）
HCl（Ajax Finechem Pty，目录号：1367-2.5L）
硫酸铵[（NH 4）2 SO 4]（AR）（Chem Supply，目录号：AA014-500G）
六水合氯化镁（MgCl 2）（AR）（Chem Supply，目录号：MA029-500G）
β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M-7154）
腺苷-5'-二磷酸葡萄糖二钠盐（ADPG）（Sigma-Aldrich，目录号：A0627-250mg）
用于植物细胞和组织提取物的蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich，目录号：P9599）
DL-二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：D-9779）
甘氨酸（Chem Supply，目录号：GA007-500G）
溴酚蓝（Sigma-Aldrich，目录号：B0126-25G）
甘油（AR）（Chem Supply，目录号：GA010-2.5L）
提取缓冲液（参见配方）
1x电泳缓冲液（参见配方）

设备

凝胶罐（XCell SureLock）（Invitrogen，目录号：EI0001）注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Novex ^TM ，目录号：EI0001"。
移液管（Thermo Fisher Scientific，型号：Finnpipette F1）
分光光度计（Agilent Technologies，型号：Cary 300 Bio UV-Visible分光光度计）
酶标仪（BMG LABTECH GmbH，型号：FLUOstar Omega Microplate Reader）

程序

准备8％Native-PAGE凝胶

准备胶盒
两个商业盒和自组装 ?可以使用具有玻璃板的盒。如果不使用商业盒，玻璃板，1毫米间隔和梳子需要彻底用MilliQ水然后用70％乙醇洗涤（使用1mm凝胶得到比1.5mm凝胶更好的分辨率）。玻璃板需要用夹具固定 - 不要夹紧夹具经过间隔垫片内部。的通过静置板将板的底部密封在熔融的1ml 2％琼脂糖在0.3M Tris/HCl，pH8.8中的溶液倒在Glad包装上

准备如表1所示的分离凝胶层（8％Native-PAGE）

首先从3.763毫升水中的牡蛎中溶解34.5毫克糖原（对于1 ?凝胶）或69mg糖原在6.945ml水中（对于2个凝胶）在15ml蓝色中盖猎鹰管。
加入1M Tris/HCl，pH8.8和40％丙烯酰胺（37.5:1）
使凝胶溶液脱气5分钟，使用水龙头真空除去空气

添加TEMED和10％APS
表1.用于分离凝胶的化学品和解决方案

	1凝胶（7.5ml）	2凝胶（15ml）
牡蛎糖原	34.5 mg	69毫克
H sub 2 O	3.473 ml	6.945 ml
1M Tris/HCl，pH 8.8	2.475 ml	4.95 ml
40％丙烯酰胺（37.5:1）	1.5 ml	3 ml
添加下面的项目聚合凝胶
添加下面的项目聚合凝胶
TEMED	7.5μl	15微升
10％APS	45微升	90微升

注意：

用于丙烯酰胺溶液的提示和管子需要在丙烯酰胺废物箱中丢弃，以进行有毒废物管理。
<10％APS：制备500μl溶液，并等分至65μl每管和储存于-20°C。从一个管子中取出-20°C的冷冻机，每次使用。同一管只应在解冻和储存后使用1周在4℃。解冻后超过1周后丢弃管。

将凝胶混合物倒入盒中，低于底部1-1.5厘米梳使用1ml移液管。在凝胶顶部加入0.5ml异丙醇 ?混合盒内部以平整凝胶的顶部并帮助凝胶聚合。离开凝胶混合物聚合约30分钟 ?在室温下
在添加堆叠凝胶层之前，倒入并用MilliQ H 2 O洗涤至少两次。小心擦拭 MilliQ H sub 2 O在两个板之间用Kimwipe去除尽可能多的过量的MilliQ H 2 O尽可能不接触凝胶。

准备堆叠凝胶层

使堆叠的凝胶混合在15ml蓝帽Falcon管中，如表2所示
表2.堆叠凝胶的解决方案

	1凝胶（2.5ml）	2凝胶（5ml）
0.5 M Tris/HCl（pH 6.8）	650微升	1.3 ml
40％丙烯酰胺（37.5:1）	285μl	570微升
H sub 2 O	1.5475 ml	3.095 ml
添加下面的项目聚合凝胶
添加下面的项目聚合凝胶
TEMED	2.5μl	5微升
10％APS	15微升	30微升

将堆叠的凝胶倒入盒中并加入梳子。如果浇注多于一个凝胶，将梳子添加到第一凝胶的堆叠凝胶倾倒前倒第二凝胶。留下堆叠胶混合物另一个?30分钟聚合
如果计划在第二天运行凝胶，凝胶需要用Glad-wrap覆盖并在4℃下储存。

准备蛋白质样品

蛋白质提取
以下蛋白质提取步骤需要在冰上或4℃下处理以避免蛋白质降解。
1. 取1-2发育内胚乳（开花后12至15天），并置于Eppendorf管中，然后称重。
2. 每100 mg组织加入100μl提取缓冲液（见配方）。
3. 使用epipestle将种子研磨成浆，在4℃下以14,000×g旋转15分钟。
4. 将上清液转移到新的Eppendorf管中
5. 如果沉淀物与上清液混合，旋转5-10分钟再次在4℃并将上清液转移到另一个新的Eppendorf管中。

蛋白质定量

准备蛋白质浓度标准曲线

通过用MilliQ H 2 O以1:4的比例稀释BSA溶液（1mg/ml）制备BSA溶液（0.25mg/ml）。

使用BSA构建蛋白质浓度的标准曲线（0.25mg/ml），如表3中对于1ml比色皿或表4对于96孔UV 微孔板
表3.制备1 ml比色皿的蛋白质标准品

蛋白质浓度（μg/1,100μl）	BSA体积（μl）	H <2 O（μl）	Coommassie加蛋白测定试剂（μl）
0	0	100	900
5	20	80	900
10	40	60	900
15	60	40	900
20	80	20	900
25	100	0	900

表4. 96孔紫外微孔板的蛋白标准品的制备

蛋白浓度（μg/220μl）	BSA体积（μl）	H <2 O（μl）	Coommassie加蛋白测定试剂（μl）
0	0	20	180
5	4	16	180
10	8	12	180
15	12	8	180
20	16	4	180
25	20	0	180

样品的制备
对于1ml比色皿，将3μl样品加入到97μlH 2 O和900μlCoomassie Plus蛋白测定试剂中。
对于96孔板，向19μlH 2 O（或更多）和180μlCoomassie Plus蛋白测定试剂中加入1μl（或更少）的样品。
用比色杯分光光度计或96孔UV微孔板微孔板读数器测量蛋白质吸光度
1. 在分光光度计或酶标仪上测定蛋白质标准品和样品
2. 读取595 nm处的吸光度。
3. 使吸光度与标准曲线匹配。将样品中的μg除以 ?加入的μl数，在这种情况下为3，得到最终浓度 μg/μl
4. 检查颜色是否在标准的颜色范围内。如果没有，相应减少或增加样品量
5. 通过将样品在液氮中冷冻并在-80℃下储存来储存蛋白质样品

注意：

同时读取蛋白质标准品和样品的吸光度。
在Excel中构建蛋白质标准曲线，如图1所示：
1. 构造散点图。
2. 在Excel工作表中选择资料，按一下[插入]标签，然后按一下[图表]标签，再按一下[散布]图示，然后新增「趋势线」。
3. 在类型选项卡下，选择"线性"。
4. 选中"设置截距= 0"并选中"在图表上显示方程"和"在图表上显示R平方值"。
5. 使用方程式确定样品的蛋白质含量（不要忘记除以加入的样品的μl数浓度（μg/μl）。
  
  图1.测量的标准曲线蛋白质浓度，使用BSA作为蛋白质标准品。 X轴是蛋白质浓度，Y轴是在595测量的吸光度 nm。

凝胶电泳
1. 装配凝胶。
2. 将800 ml 1x电泳缓冲液倒入凝胶罐中。
3. 在冰上向蛋白质样品溶液中加入上样缓冲液在通风橱中执行以下步骤：
  向每100μl蛋白质样品溶液中加入：
  10μl0.5M Tris-HCl（pH 6.8）
  10μlβ-巯基乙醇 5μl0.6％溴酚蓝在80％甘油中
4. 重新计算浓度以允许添加上述变性 ?缓冲液到蛋白质。新的最终浓度=（初始体积/最终体积）×初始浓度
5. 每个样品加入100μg总蛋白。
6. 如果空间允许，在梯子和样品之间留出一条通道
7. 在100 V（或最大安培，每个凝胶15 mA）的最大电压下运行凝胶。
8. 运行凝胶，直到溴酚蓝染料到达凝胶底部

测定淀粉合酶活性

制备淀粉合酶测定缓冲液，如表5所示
表5.淀粉合酶测定缓冲液

	10 ml	15 ml	注意
10x Tris-甘氨酸（10x运行缓冲区）	1 ml	1.5 ml
2 M（NH 4）2 SO 4 4	667微升	1 ml
2 M MgCl 2	37微升	55微升
BSA（干燥）	6.7mg（0.0067g）	10mg（0.010g）
β-巯基乙醇	47μl	70微升
360 mM ADPG（-20°C）	34微升	51微升	添加最后一个，因为它很快熄灭
H sub 2 O	8.22 ml	12.32毫升

2 M MgCl 2	2 M（NH 4）2 SO 4 4
MW = 203.3g 2 M = 4.066g/10ml	MW = 132.13g 2 M = 2.643g/10ml

注意：360 mM ADPG需要保持为34μl等分试样，并保存在-20°C。在使用之前，从冷冻箱中取出一根凝胶。

在室温（?22℃）下将凝胶与淀粉合酶测定缓冲液孵育过夜
用MilliQ H 2 O洗涤凝胶两次。
用碘溶液（含2％KI，0.2％I 2）染色凝胶，棕色带出现如图2，通常约10分钟。更换碘溶液，如有必要，10分钟后
如果需要，凝胶可以保持在碘溶液中。

代表数据

可以预期淀粉合酶活性结果的代表性实例如图2（b）（来自图8A，Li等人，2011）和小麦籽粒中的图2（c）图2，McMaugh等人，2014）。

图2.大麦和小麦发育的胚乳的淀粉合酶活性（a）。用碘溶液染色前的天然PAGE凝胶。（b）。显示在用碘溶液染色后在大麦发育胚乳中的淀粉合酶I和IIIa活性的天然PAGE凝胶。（C）。显示在用碘溶液染色后小麦发育胚乳中的淀粉合酶I和IIIa活性的天然PAGE凝胶。
这个协议在我们手中是高度可重现的。天然聚丙烯酰胺凝胶的质量决定了蛋白质条带的质量。 TEMED和APS的质量可能影响凝胶质量，然后影响蛋白质带质量

笔记

来自牡蛎的糖原是天然聚丙烯酰胺凝胶（天然PAGE）的最佳底物。

食谱

提取缓冲
加入20μl1M磷酸钾缓冲液，pH7.5（终浓度：50mM KPi）加入1μl500mM EDTA，pH7.5（终浓度：5mM EDTA）
加入400μl50％甘油（最终浓度：20％甘油）加入567μlMilliQ H sub 2 O 2 / 添加蛋白酶抑制剂混合物为植物细胞和组织提取物和DTT缓冲液，如下准备提取
添加2微升蛋白酶抑制剂鸡尾酒植物细胞和组织提取物
加入10μl500mM DTT（终浓度：5mM DTT）
1×电泳缓冲液
加入80 ml 10x运行缓冲液
添加0.15 g/L的DTT
用蒸馏水补足至800毫升 10x运行缓冲液（10x Tris-甘氨酸储备液）
1.9M甘氨酸（144g/L） 250mM Tris（30.3g/L）

致谢

该协议从以前的出版物（Abel等人，1996）修改。作者感谢Behjat Kosar-Hashemi，Emma Anschaw，Steve McMaugh，Sapna Vibhakaran Pillai和Hong Wang对这个协议的优化和测试的贡献。作者还感谢CSIRO植物工业，CSIRO食品未来旗舰和ACVL有限公司在研究过程中提供资金资源测试本协议。

参考文献

Abel，G.J.，Springer，F.，Willmitzer，L。和Kossmann，J。（1996）。对编码来自马铃薯的新型139kDa淀粉合酶的cDNA的克隆和功能分析（ Solanum tuberosum L.）。植物J 10（6）：981-991。
Li，Z.，Mouille，G.，Kosar-Hashemi，B.，Rahman，S.，Clarke，B.，Gale，K.R.，Appels，R.and Morell，M.K。（2000）。小麦淀粉合成酶III基因的结构和表达。表达基因中的基序定义淀粉合酶III基因家族的谱系。植物生理学123（2）：613-624。
Li，Z.，Li，D.，Du，X.，Wang，H.，Larroque，O.，Jenkins，C.L.，Jobling，S.A.and Morell，M.K。大麦amo1基因座与淀粉合成酶IIIa基因紧密连锁，并负调节颗粒结合的表达淀粉合成基因。 J Exp Bot 62（14）：5217-5231。
McMaugh，SJ，Thistleton，JL，Anschaw，E.，Luo，J.，Konik-Rose，C.，Wang，H.，Huang，M.，Larroque，O.，Regina，A.，Jobling，，MK和Li，Z.（2014）。淀粉合成酶I表达的抑制影响小麦胚乳中淀粉的颗粒形态和颗粒大小和精细结构。 65（8）：2189-2201。