材料和试剂

完整叶绿体的分离
1. Miracloth（Merck Millipore Corporation，Calbiochem ，目录号：475855）
2. Gauze（Hakujuji Co.，型号：FC-gauze）
3. 拟南芥的幼苗
  野生型（Columbia-0）植物，磷脂酰肌醇4-激酶（
  PI4K ）α1敲低植物，pi4kβ2-1< em4突变体和< im>PI4Kα1</p>敲低植物在MS琼脂平板上生长4天，然后转移到具有或不具有5μM地塞米松（DEX）的琼脂板上，并生长1周。 PI4Kα1表达的下调是通过在PI4Kα1敲除植物中的DEX处理和在p14Kβ2-1突变体中产生的PI4Kα1敲除植物诱导。对于用抑制剂的治疗，将野生型4日龄幼苗转移到具有PI4K的琼脂平板上抑制剂，200μM渥曼青霉素（WM）或25μM氧化苯基砷（PAO） ?磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）抑制剂，50μMLY294002（LY），或不含抑制剂（DMSO）并生长3天。
4. Percoll（GE Healthcare，Dharmacon，目录号：7-0891-01）
5. Bradford测定试剂盒（Bio-Rad Laboratories，目录号：500-0006JA）
6. 1x蛋白酶抑制剂混合物（Nakarai，目录号：03969-21）
  注意：目前，它是"Nacalai tesque，目录号：03969-21"。
7. 山梨醇
8. HEPES-KOH（pH7.5）
9. EDTA
10. 研磨缓冲液（参见配方）
11. 80％Percoll或40％Percoll（参见配方）
提取PI4P
1. 0.75M三氯乙酸（TCA）（Wako Pure Chemical Industries，Siyaku，目录号：203-04952）
2. 5％（w/v）TCA和1mM EDTA
3. 甲醇（Wako Pure Chemical Industries，Siyaku，目录号： 137-01823）：氯仿（Wako Pure Chemical Industries，Siyaku，目录编号：038-02601）（2:1，v/v）
4. 甲醇：氯仿：12N HCl（Wako Pure Chemical Industries，Siyaku，目录号：080-01066）（80:40:1，v/v/v）
PI4P水平的测量
1. PI（4）P Mass Strip Kit（Echelon Biosciences，目录号：K-4000E）
2. 来自牛血清（BSA），不含脂肪酸的白蛋白（Wako Pure Chemical Industries，Siyaku，目录号：017-15146）
3. HRP底物溶液（Thermo Fisher Scientific，Pierce，目录号：NCI32132）
4. 磷酸盐（pH 7.4）
5. NaCl
6. 0.1％（w/v）Tween-20
7. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见Recipes）
8. PBST（参见配方）

设备

均质机（Microtec Co.，型号：NS-51）
离心机（TOMY SEIKO CO。，型号：MX-200和GX-250）
摆动转子（TS-7C）
油漆刷
巴斯德吸管（Sansyo，Iwaki，目录号：IK-PAS-9P）
真空干燥器（离心蒸发器）（Shimadzu Corporation，型号：SPE-200）
超声波仪（SHARP CORPORATION，型号：UT-106）

程序

完整叶绿体的分离
1. 取0.5-1g拟南芥的幼苗。整个幼苗使用1周龄植物或11天龄植物的芽。
2. 加入6ml研磨缓冲液并用匀浆器在冰上匀化3-5次3秒。
3. 通过2层纱布和一层Miracloth（放在Miracloth上的纱布）过滤匀浆。
4. 在4℃下以2500xg离心15分钟。弃去上清液并轻轻地将沉淀重悬在1.5ml的研磨缓冲液中画笔。用刷子轻轻地刷小丸一点点避免破坏完整的叶绿体。注意移液沉淀打破叶绿体。
5. 加入1.5毫升研磨缓冲液和1毫升80％Percoll，轻轻混合。（Percoll的最终浓度为20％。）
6. 准备Percoll步梯度。首先分层3ml的80％Percoll 然后在15ml离心管中加入5ml 40％Percoll。把尖头移液管表面，并缓慢放置40％Percoll，以避免干扰的梯度。见图1.
7. 在Percoll梯度顶部放置4ml粗制叶绿体悬浮液（步骤A5的结果）
8. 使用摆动转子在4℃下以3,200×g离心30分钟。将加速和减速的速度设置为最小。
9. 用对应于完整的巴斯德吸管收集绿色带叶绿体在40％和80％至2ml管之间的界面。去掉仔细地上带（破碎的叶绿体）和转移下带到具有巴斯德移液管的2ml管。见图1.
10. 加入研磨缓冲液至多2ml，并在4℃下以700×g离心5分钟。
11. 弃去上清液，洗涤沉淀两次再悬浮于1ml研磨溶液中并在4℃下以700×g离心5分钟。
12. 将颗粒（完整叶绿体）悬浮在0.3ml研磨缓冲液中。
13. 取一部分样品测量蛋白质浓度（步骤B9）
  
  图1.用Percoll梯度分离完整叶绿体离心。 1.将40％Percoll置于80％Percoll上;放置粗叶绿体悬浮液在40％Percoll上; 3.管前离心; 4.离心后管; 5.取下上部带（断裂的叶绿体）; 6.收集下部带（完好无损叶绿体）。
提取PI4P
1. 加入750微升冰冷的0.75 M TCA到250微升完整的叶绿体样品。涡旋并在冰上孵育5分钟。
2. 在4℃下以700×g离心5分钟，弃去上清液。 ?加入1ml含有1mM EDTA的5％TCA至沉淀并涡旋30秒。
3. 在室温下以700×g离心5分钟，弃去上清液。向沉淀中加入1ml甲醇：氯仿（2:1）提取中性脂质并涡旋3次，每次30秒间隔5分钟，室温。
4. 700离心机离心。 ?5分钟，弃去上清液。加入1毫升甲醇：氯仿（2:1）洗脱，以提取中性脂质 ?并在室温下涡旋1分钟。
5. 离心机 700×g在室温下处理5分钟，弃去上清液。加向沉淀中加入750μl甲醇：氯仿：12N HCl（80:40:1）提取酸性脂质并涡旋4次，每次30秒 ?的5分钟。
6. 加入250μl氯仿和450μl0.1M HCl并涡旋。
7. 以700×g离心5分钟，收集下层相并将其转移到新试管中。
8. 在真空干燥器中干燥样品。
9. 测量蛋白浓度。加入1-10μl样品（步骤A13）到1ml的Bradford测定试剂（1:5稀释）中。孵育5分钟并测量595nm处的吸光度。测量吸光度 ?的标准蛋白样品。使用标准品制作标准曲线蛋白质样品并计算PI4P浓度读取。蛋白质的浓度通常为0.3-0.8mg/ml。
PI4P水平的测量
1. 向样品中加入15μl氯仿：甲醇：水（1:2:0.8，v/v/v）。 ?涡旋30秒，并在冰水浴中声处理（100％输出）5 min。再次涡旋30秒。
2. 离心15,000×g 5分钟并将10μl上清液转移到新试管中。不要吸取沉淀 ?管的底部。
3. 将样品点样到PI（4）P条上。点1μl ?的样品。在同一区域再次点样前，干燥 ?位置。在所有样品点样后，在30℃下干燥该条30分钟室内温度。见图2.
4. 孵育膜封闭溶液（PBS中3％无脂肪酸的BSA）在室温下封闭1小时温和搅拌。
5. 孵育膜与5 ml含有1小瓶PI（4）P检测剂（2.5μg 蛋白）在室温下温和搅拌1小时。
6. 弃去溶液并用10ml PBST洗涤膜三次次，在室温下温和搅拌5分钟。
7. 用5ml含有的封闭溶液孵育洗涤过的膜 75μl次级检测器在室温下温和1小时搅动。
8. 弃去溶液并洗涤膜三用10ml PBST在室温下温和搅拌5次 ?min。
9. 用足够的ECL溶液孵育洗涤的膜，以在室温下覆盖膜5分钟
10. 用水洗涤膜三次以停止反应并干燥膜
11. 扫描膜以记录所获得的数据。参见图2。

代表数据

图2. PI4P检测测定的代表性结果从完整叶绿体提取的样品点在PI（4）P条带的左侧。将PI4P标准品（20,15,10,5,4,2,1和0.5pmol的PI4P）和磷酸肌醇对照物预点在膜上。从野生型植物的分离的叶绿体中提取的脂质，磷脂酰肌醇4-激酶（

PI4K ）α1敲低植物，pi4kβ2-1<用/不用5μM地塞米松（DEX）处理的pI4kβ2-1突变体和< em>突变体和< em>PI4Kα1敲低植物点在膜上。通过在PI4Kα1敲低植物中的DEX处理和在p14Kβ1-1敲除植物中的PI4Kα1敲低植物诱导PI4Kα1表达的下调， em>突变体。从用/不用PI4K抑制剂，200μM渥曼青霉素（WM）或25μM氧化苯氧胺（PAO）或磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）抑制剂，50μMLY294002（LY）处理的野生型植物的分离的叶绿体中提取的脂质，也被发现了。样品点是：1.没有DEX的野生型植物; 2.用DEX处理的野生型植物; 3.没有DEX的PI4Kα1敲低植物; 4.用DEX处理的PI4Kα1敲低植物; 5.没有DEX的pi4kβ2-1突变体; 6.用DEX处理的p14kβ2-1突变体; 7.不使用DEX处理的PI4Kα1敲除植物的p14kβ2-1突变体; 8.用DEX处理的pI4kβ2-1突变体的PI4Kα1敲低植物; 9.无抑制剂的野生型植物; 10.具有WM的野生型植物; 11.具有PAO的野生型植物; 12.具有LY的野生型植物。使用的缩写是：PI，磷脂酰肌醇; PI3P，磷脂酰肌醇3-磷酸; PI5P，磷脂酰肌醇5-磷酸; PI（3,4）P 2，磷脂酰肌醇3，4-二磷酸酯; PI（3,5）P 2，磷脂酰肌醇3,5-二磷酸酯; PI（4,5）P 2，磷脂酰肌醇4,5-二磷酸酯; PI（3,4,5）P 3，磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸。

笔记

在操作A期间，样品和Percoll梯度管应保持在冰上
不要使样品过于均匀。三到五次，持续3秒通常就足够了。较长的匀浆导致完整叶绿体的产量较低。
在步骤B3之后，不要将样品保持在冰上。
叶绿体的完整性可以通过相差显微镜评估。完整的叶绿体被明亮的光晕包围。破碎的叶绿体看起来很黑。参见Klinkenberg图（2014）。
提取中性脂质应进行两次以去除叶绿素。
在步骤C2不要吸取沉淀。它含有来自提取步骤的剩余蛋白质，并在膜上形成疏水膜。疏水膜防止PI4P检测器与PI4P的结合。见图3.

图3.失效的PI4P检测测定的实例将脂质与在提取步骤中剩余的碎片（步骤C2中的沉淀）一起点在膜上。它防止PI（4）P检测器与PI4P结合，因此将斑点检测为环而不是圆。

食谱

研磨缓冲器
0.33M山梨醇 30mM HEPES-KOH（pH7.5） 2mM EDTA 1x蛋白酶抑制剂混合物
无蛋白酶抑制剂混合物的高压灭菌器
在使用前加入蛋白酶抑制剂混合物
80％或40％Percoll
30mM HEPES-KOH（pH7.5） 0.33M山梨醇 2mM EDTA Percoll（80％或40％，v/v）
PBS
10mM磷酸盐（pH7.4） 150mM NaCl 高压灭菌器灭菌
PBST
PBS
0.1％（w/v）Tween-20

致谢

该协议改编自原始工作（Okazaki等人，2015），以提供详细的程序。这项工作得到JSPS KAKENHI Grant号26840089的支持。

参考文献

Klinkenberg，J。（2014）。从瞬时转化的烟草叶中提取叶绿体蛋白。生物协议 4（18）：e1238
Nakanishi，H.，Suzuki，K.，Kabeya，Y.and Miyagishima，S.Y。（2009）。植物特异性蛋白MCD1决定了与细菌衍生的MinD一起的叶绿体分裂位点。 a> Curr Biol 19（2）：151-156
Okazaki，K.，Miyagishima，S.Y.and Wada，H。（2015）。磷脂酰肌醇4-磷酸负调节拟南芥中的叶绿体分裂。植物细胞 27（3）：663-674。