材料和试剂

细菌培养皿（100×15mm）（Corning，目录号：351006）
标准培养皿（100×15mm）（Corning，目录号：70165-101）
6多孔板（Corning，目录号：353224）
50ml管（Falcon ，目录号：352098）
P15细胞（Izsler，目录号：BS-TCL206，Passage 0）中培养p19细胞（Izsler-Istituto Zoopro fi lattico Sperimentale，Lombardy和Emilia Romagna"Bruno Ubertini"，Brescia，Italy）
最小必需培养基α（α-MEM）（Sigma-Aldrich，目录号：M8042）
青霉素 - 链霉素10,000U/ml（Thermo Fisher Scientific，Gibco< sup>，目录号：15140-122）
L-谷氨酰胺2nM（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：25030-081）
二甲基亚砜（Sigma-Aldrich，目录号：D4540-100ml）
胎牛血清（FBS）（Sigma-Aldrich，目录号：F6178-50ml）
胰蛋白酶-EDTA（0.5％），无酚红（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15400-054）}
Optimem （Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：31985-070）
siPORT NeoFX转染剂（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：AM4511）
将Pre-miRNA 1（ID：000385）（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems，目录号：AM17100），Pre-miRNA 133（ID：000458）（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems ^{分子和scramble miRNA（阴性对照），其中目标编号：AM17100），Pre-miRNA 499（ID：001045）（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems} （Thermo Fisher Scientific，Ambion TM，目录号：AM17110）
培养基（见配方）
标准分化培养基（见配方）
混合A（参见配方）
混合B（参见配方）

设备

Pipetus ^?移液器
层流罩（EuroClone S.p.A.，型号：S @ flow 1.8）
设置在37℃，5％CO 2（Panasonic Corporation，Sanyo，型号：MCO-18AC）的加湿细胞培养孵育器
装备有相位对比滤光器（ZEISS，型号：Observer Z1）的倒置明亮光显微镜

程序

在标准培养皿中扩增P19细胞，从第0代至第5代，并用培养基饲养细胞。当细胞达到80-90％汇合时，使用5％胰蛋白酶/EDTA在37℃，5％CO 2下收获P19细胞5分钟（图1A）。
在第1天，将4×10 5个细胞转移到8ml标准分化培养基中的100mm细菌培养皿中，并在37℃，5％CO 2中孵育细胞24小时，/sub>。
在第2天，加入5ml新鲜标准分化培养基（总体积培养基：13ml，新鲜分化培养基必须在使用前准备）。
在第3天，P19细胞的形态学变化开始可见：一些细胞簇沉积在培养皿的底部，变成EB并开始分化成CMC。一些分离的细胞可以保留在悬浮液中：这些细胞不向心脏谱系定向，并且将不粘附在培养皿的底部，因为使用细菌培养皿。当交换细胞培养基时，这些未分化的P19将被丢弃
替换5毫升新鲜标准分化培养基：用10毫升吸管轻轻吸出5毫升培养基，避免吸入EB;然后用新的10ml移液管加入5ml新鲜分化培养基
在第4天，EB准备用于转染（图1B）。在两个单独的15ml锥形管中制备混合物A和混合物B.
轻轻加入混合物B混合A，倒置管3次，并在室温下孵育10分钟
使用25毫升吸管，收集和转移包含在一个细菌盘中的EB到50毫升管，让EB沉淀。
将1ml转染混合物等分到6多孔板的每个孔中;在那些将被用作对照的孔中仅加入标准分化培养基。
EB先前收集在50ml管中现在将被解决。小心吸出培养基并将EB重新悬浮于14.4ml新鲜标准分化培养基中
转移2.4毫升重悬EB每个孔，轻轻摇动多孔板使用1毫升吸头。现在摇动板来获得均匀分布的细胞。每次你选择一个混合物的等分试样，吸移管向上和向下重新暂停EB。在37℃，5％CO2下孵育过夜。
在第5天，EB将粘附在培养皿的底部（图1C）。您现在可以用新鲜的分化培养基交换培养基，以允许EB的扩增。该步骤代表心脏诱导方案的"第1天"。可以进行实时PCR以定量miRNA转染效率
在诱导方案的第5天，第一次收缩的EB应该出现并且将在显微镜下可见（视频1）。

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视频1.打败胚状体

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早期心脏分化可以通过PCR和/或免疫细胞化学从诱导方案的第7天开始记录。更晚期的心脏分化将从诱导方案的第14天开始出现（图1D）（Pisano等人，2015 http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/stem.1928/pdf ，图2,3和6）。

图1.P19细胞和EB。 A.维持在培养基中的未分化P19的图像; B.心脏分化方案期间的EB形成，第4天; C.当EB从细菌盘转移到培养皿时，它们粘附在板上; D.心脏分化7天后，附着的EB将扩大并叩击

笔记

操纵miRNA分子需要使用无RNA酶的塑料和试剂。此外，如果用于miRNA转染的流动罩也用于其他实验，我们建议用10％NaClO预处理表面。
在转染方案中，您必须仔细无菌地在流动罩下工作，因为Optimem ^?培养基不含抗生素。

食谱

培养基
存储介质在4°C;当α-MEM中包含的酚红变为粉红色（或黄色）时，丢弃培养基并使用新鲜培养基。
α-MEM 500ml
FBS 55 ml
L-谷氨酰胺5.5ml
青霉素 - 链霉素5.5ml
标准分化培养基（使用前准备新鲜）
培养基
DMSO 0.5％
混合A（使用前准备新鲜）
使用Optimem ^?
稀释pre-miRNA溶液我们使用pre-miRNA1和pre-miRNA499的浓度为10 nM，pre-miRNA133和scramble miRNA的浓度为5 nM。
在室温（RT）下孵育混合物10分钟
对于一个6多孔培养皿，我们使用3ml的Mix A
混合B（使用前准备新鲜）
使用Optimem ^?稀释siPORT ^? 1:50
在RT孵育10分钟
对于一个6多孔培养皿，我们使用3ml的Mix B

致谢

该协议的开发由意大利圣基茨帕利亚的IRCCS Policlinico支持; Fondazione Cariplo（2007-5984）和意大利部长（GR-2008-114278）。我们要感谢Laurene Kelly帮助编辑手稿。

参考文献

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