材料和试剂

25ml T烧瓶NC通气帽（SARSTEDT AG& Co，目录号：83.1810.002）
液氮便携式容器（Nalgene塑料杜瓦瓶）（Thermo Fisher Scientific，目录号：S34074C）
无菌注射器和针（Thermo Fisher Scientific，目录号：10142534）
一次性移液管（Samco细尖，1ml）（VWR International，目录号：16001192）
1ml和1-200μl的气溶胶阻挡尖端（Thermo Fisher Scientific，目录号：02-707-42）
螺旋盖塑料小瓶（2ml）彩色编码帽（黄色，蓝色，绿色和红色）（USA Scientific，目录号：1420-8706,1420-8701,1420-8702和1420-9704）
顶端塑料小瓶（1.5ml）（USA Scientific，目录号：1615-5510）
15ml Falcon管（SARSTEDT AG& Co，目录号：62.554.205）
透析的，无菌过滤的胎牛血清（FBS）（不含血清代谢物），10-12kDa（Atlanta Biochemical，目录号：S12650）
示踪剂实例：葡萄糖，葡萄糖，葡萄糖，葡萄糖，葡萄糖，葡萄糖，葡萄糖， 13 5 ，¹⁵ N <2> - 谷氨酰胺
来源：13 C葡萄糖/D-葡萄糖（[U- 13 C]，99％）（Cambridge Isotope Laboratories，目录号：CLM-1396-CTM），葡萄糖/D-葡萄糖（1→2），葡萄糖/D-葡萄糖> 2％，99％）（Cambridge Isotope Laboratories，目录号：CLM-504），13 C ，15 N谷氨酰胺/L-谷氨酰胺（^{13 5，99％; ^{15 N 2 /99％）（Cambridge Isotope Laboratories，目录号：CNLM-1275）或
葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：660663），SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO： > -1,2-葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：661422），L-谷氨酰胺 - 13 C 15 S，15 S - > 2（Sigma-Aldrich，目录号：607983）}}
青霉素+链霉素：GE Healthcare PEN/STREP/FUNGIZONE 100ml（Thermo Fisher Scientific，目录号：SV3007901）
方案 10％中性缓冲福尔马林（Thermo Fisher Scientific，目录号：032-059）
在PBS中的25％（w/v）无菌过滤的13 C葡萄糖（0.2μm）（储备溶液 - 可以冷冻，分装并在4℃下储存）
液氮
70％乙醇（v/v）
60％乙腈水溶液（v/v）（Sigma-Aldrich，目录号：L010400）
氯化钠（NaCl）（Thermo Fisher Scientific，目录号：S271-1）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：S0876）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P9791）
氨基酸：甘氨酸，L-精氨酸，L-天冬酰胺，L-天冬氨酸，L-胱氨酸2HCl，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，L-组氨酸，L-羟脯氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸， L-赖氨酸盐酸盐，L-甲硫氨酸，L-苯丙氨酸，L-脯氨酸，L-丝氨酸，L-苏氨酸，L-色氨酸，L-酪氨酸二钠盐，L-缬氨酸
维生素：生物素，氯化胆碱，D-泛酸钙，叶酸，异肌醇，烟酰胺，对氨基苯甲酸，盐酸吡哆醇，核黄素，盐酸硫胺素，维生素B12
硝酸钙[Ca（NO 3）2] 2 SiO 4 [O]
硫酸镁（MgSO 4）
谷胱甘肽（还原）
酚红
缺少感兴趣的示踪剂的相关介质（例如，DMEM，RPMI，其他定义的介质）：
一个。 Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）是不含葡萄糖，谷氨酰胺，丙酮酸盐碳酸氢盐和酚红的粉末配方，在用于SIRM研究的制剂中提供相当大的灵活性（Sigma-Aldrich，目录号：D5030）（参见Recipes ）
b。 RPMI 1640是不含葡萄糖和谷氨酰胺但含有碳酸氢盐和酚红的液体培养基（MP Biomedicals，目录号：091646854）（参见配方）。
0.2微米无菌过滤的磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见配方）
用于0.2％13 C 6 - 葡萄糖，2mM 12 C-Gln（100ml）的培养基组成（参见配方）
用于0.2％葡萄糖，2mM葡萄糖，2mM葡萄糖，2mM葡萄糖，2mM葡萄糖，2mM葡萄糖，2mM葡萄糖，/100ml> -Gln（100ml）（参见配方）

设备

第二类生物安全罩
具有氧传感器和CO 2传感器（Thermo Fisher Scientific，型号：Hera cell 150i）的Trigas培养箱
灭菌摇床（Rotoshake Genie）（Scientific Industries，型号：SI-1100）
液氮冷冻仓
（"紫色顶部"）（BD，目录号：366643）
带有旋转转子的冷冻离心机，其可使用转子（Thermo Fisher Scientific，目录号：75003181）接受真空容器[例如 Sorvall Legend X1R（Thermo Fisher Scientific，目录号：75-004-261）
移液器（可变尺寸范围）（USA Scientific ErgoOne）
Weck Knife/Dermatome（George Tiemann& Co.，目录号：222-5-523）
称量船（Thermo Fisher Scientific，目录号：08732113和08732115）
4位平衡（Thermo Fisher Scientific，Mettler-Toledo，目录号：0133525）
冰桶（Thermo Fisher Scientific，目录号：02-591-44）
尖锐的解剖剪刀（Thermo Fisher Scientific，目录号：08940）
Excelta?塑料镊子（Thermo Fisher Scientific，目录号：17-456-066）
数码相机

程序

组织采购
所有组织必须根据IRB批准的方案购买。随着活人体组织的处理，所有人员必须接受和维持生物安全性，HIPAA和CITI认证。
方案1中给出了整个过程的概述。

计划1. FlowChart 。Preop：术前房间;或：手术室。要采取的薄切片的数量取决于肿瘤的大小。一片组织也在OR中快速冷冻，并将另外的组织置于福尔马林中用于病理分析
1. 血样提供关于代谢状态的总体信息的个体受试者，并且可以使用血沉棕黄层提取DNA或RNA用于序列分析
2. 取10ml样品血液应该在术前被抽成紫色的顶部真空采血管（K 2 2 -EDTA）。其他抗凝剂如柠檬酸盐或不应使用肝素，因为它们干扰代谢测定。一个切除后应手术切除血液样本。的将血液倒置两次以确保EDTA的溶解，并保持冰抽血后立即。血液应分离包装的红细胞，血沉棕黄层和血浆在30分钟内通过离心 ?3,500 x g 在4°C下在摇摆转子中保持15分钟后续操作应在BSL2 ⁺生物安全柜中进行注意：我们使用以下颜色代码存储：红色=全血，黄色=血浆，绿色=血沉棕黄色，蓝色=尿液。
3. 将血浆在1℃下吸入预冷的无菌2ml螺旋盖小瓶中 ?ml等分试样并在液氮中快速冷冻。吸入面膜使用广口塑料吸管插入2ml螺旋盖小瓶和闪光冷冻在液体N 2中。
4. 这些实验已经进行新鲜切片的成对癌（CA）和非癌（NC）肺从非小细胞肺癌切除的组织（Xie et al。，2014）和胰腺癌患者。切除后，薄切片（0.5-1 mm厚） ?的组织从视觉上非坏死的表面切除纤维化肿瘤区域使用Weck切片机在手术室（OR），在大约5-10分钟内切除。大约1cm 2组织（参见图1A）。控制非癌组织从a 类似地获得远（> 10cm）区域。病理学家现场检查CA和NC组织标本。高度坏死组织舍弃。
5. 同时，一小块大块CA组织应置于DMEM或其他适当介质保存室内植入受体NSG小鼠的温度患者衍生的异种移植物或PDX。每个CA和NC的小片将组织浸泡在福尔马林中用于病理检查或闪光冷冻在液体N 2中用于基于图像的代谢分析。
6. 哪里组织采集在OR是不切实际的（如结肠直肠或乳腺癌切除术），可以在病理学中制备切片实验室靠近OR。与新鲜切除的比较 ?组织，速度是必不可少的，因为新陈代谢正在快速变化。每当可行，应在OR中进行组织冷冻
7. 的将切片置于两次灭菌的称重的一滴无菌PBS中以防止粘附和均匀铺展切片。每个重量船预先编号为CA或NC切片。重量船上的组织然后被拍摄。每个切片用无菌PBS简单冲洗，印迹（两次），然后小心地置于预编号（使用耐乙醇标记笔）预配（记录皮重） T25-含有10ml DMEM（或其他相关培养基）的烧瓶合适的示踪剂（例如10mM，13 C，6葡萄糖或2mM，13 C，15 C， 10％透析的FBS（根据需要）和1×青霉素+胰蛋白酶+ 链霉素。带切片的烧瓶被带到培养室尽快并用70％乙醇喷雾，并擦干将它们放在生物安全罩中。
8. 移取200微升培养基从每个烧瓶中取出至1.5ml snap-cap管（t 0次 - 零时间培养基样品）。 ?在4℃下以10,000×g离心10分钟以除去组织碎片。转移100微升到去皮重的1.5微升snap-cap管代谢物提取并称量转移的介质。将剩余的介质转移到1.5 ml螺旋盖管，在-80℃下长期保存
9. 在生物安全罩内的2位置平衡中称重烧瓶，并在烧瓶上记录重量。
10. 将烧瓶转移到含有摇床设置为低的CO 2培养箱中振幅摇摆（足以确保液体移动）没有非层流的切片）图1B）设置为37℃和5％CO 2，氧气设置为所需水平（例如 20％，1％）。
11. 烧瓶连续轻轻摇动24至48小时进行气体交换以在组织表面维持恒定的营养物供应，同时避免废物如酸的局部积聚。
12. 如需要的，介质可以每12小时刷新，并在0,6,12， ?24 ...。 h用于分析营养物吸收和废物产生。烧瓶 ?在每个培养基取样点和烧瓶之前和之后称重在烧瓶上记录重量。
组织收获
1. 孵育24小时后，称重烧瓶。
2. 将烧瓶置于冰上立即从培养箱中取出以进一步最小化代谢。一次可以收获多达6个烧瓶。保持组织在收获期间尽可能多地在冰上切片
3. 使用移液管，吸出并将条件培养基转移到15-ml锥形离心管中
4. 将介质以3,500至4,690 x g，4℃离心15分钟，以除去任何颗粒和碎屑。
5. 吸取100μlT sub 24培养基上清液到1.5-ml帽盖管中用于代谢物提取。
6. 吸取1毫升培养基等分到2毫升螺旋盖管长期储存在-80℃。
7. 将剩余的培养基单独储存在-80℃的7ml小瓶中，用于外来体分离等目的
8. 倒置和轻拍烧瓶移动组织切片到盖或颈部区域用于取出。保持瓶子在冰上倒置。
9. 在冰冷的10 ml冷PBS中，连续洗涤组织切片3次，每次在50 ml烧杯中。
10. 将干净的Kimwipe的组织切片和照片在一个小称量船上的扁平切片
11. 称重整个组织切片在小称重船上，并记录重量。
12. 分开一小块保存在1ml缓冲福尔马林中 ?在1.5ml snap-cap管中用于组织学。剩余的组织切片分开均匀，每片应重量不超过20-30毫克湿重量以促进组织匀浆和提取效率。称重之后，立即将每片以1L速冻。 N 2和放置在前liq。 N 2冷冻1.5-ml帽盖管长期使用储存于-80℃。
13. 在福尔马林中6-8小时后，用70％乙醇替代福尔马林用于组织学制备的组织片
14. 在冷的60％乙腈（v/v）和提取物中均质化组织组织匀浆根据标准进行代谢物分析协议（Fan，2012; Fan，2010）同位素解析分析技术（例如，NMR和MS）（Fan，2012）（图1C）（Lane ，2008）。
15. 本协议描述 ?用于薄组织切片的稳定同位素标记的方法。 SIRM 分析涉及同位素异构体的定量（通过NMR）和同位素异质体（MS），源自源的代谢转化在细胞或组织中的分泌（例如，13 C葡萄糖或13 C，15 N谷氨酰胺）（图1C）。通过NMR和质量的SIRM分析的技术光谱测定法在Sellers等人的（2015）中有详细描述; Lane等 al。（2008）和Fan 等人（2012）。

代表数据

图1.肺实质细胞实验。A.肺腺癌（CA，右）附近的非癌性肺组织（NC，左） B.T25-烧瓶在CO 2培养箱内的摇床上; C.来自非小细胞的CA对NC肺切片的提取物的代表性1D H（<13 C）HSQC NMR谱（在14.1 T，15℃记录）肺癌（NSCLC）患者在10mM 13 C 16 - 葡萄糖存在下温育24小时。如（Sellers等人，2015; Fan，2012）所述粉碎和提取组织切片，其产生三个阶段 - 含有极性代谢物的上层水相，含有非极性代谢物的下层有机相（主要是脂质）和含有蛋白质的界面相。这里，将上层相冻干并再溶解于含有50％D 2 O和25nmol DSS-d 6的磷酸盐缓冲液中，其用作化学位移参考和浓度标准（Fan和Lane，2013）。 HSQC光谱检测直接连接到13 C的质子，并且因此给出从来源分子（在这种情况下为葡萄糖）引入了13 C的代谢物的读出。在相同条件下记录癌症和非癌性组织的光谱，并将绝对强度相对于组织蛋白质重量标准化。使用MNOVA（Mestrelab Research，Santiago de Compostela，Spain）中的峰拟合函数确定峰面积。
在CA组织切片中增强各种^{13 C标记的代谢物的产生是明显的，包括13 C-乳酸盐（Lac），其与Warburg效应或加速糖酵解一致肿瘤组织（Warburg，1956）。}

笔记

这些程序已在新鲜切除的NSCLC和胰腺癌以及患者来源的小鼠异种移植物中测试。其他组织可能需要对培养基的组成和代谢活力的潜伏期长度进行实验
较大或炎性肿瘤可能具有需要避免的相当大的坏死或纤维化区域。
Weck切片机是手持的，但是在实践中， 1mm厚。通过从照片测量切片的面积容易地估计切片厚度，并且从湿重测量平均厚度h =重量/面积。
一些肿瘤是高度粘液的，并且更难以可再现地切片
Weck切片机的替代物是振动切片机，其可以从坚硬而不是软组织中再现地产生较薄的切片（参见¹⁰），但是更慢。非常薄的切片（100-200μm）可能显示出相对较大的伤口反应，并且更脆弱
由于许多肿瘤不仅在肿瘤的不同区域中的癌症/基质含量方面是异质的，而且在遗传学方面也是如此，因此建议从肿瘤获得多个切片以覆盖这种异质性。这也使每个切片的组织病理学检查至关重要
没有病理检查，一些肿瘤的边缘不明显。应当对接近肿瘤以及远离肿瘤的组织进行取样用于比较。

食谱

DMEM和RPMI Medium 1640
对于SIRM研究，应使用不含谷氨酰胺或葡萄糖的培养基，在基本培养基中补充合适浓度的富含13 C的前体。

组件	分子量	集中（mg/L）	摩尔浓度（mM）RPMI	摩尔浓度（mM）DMEM
氨基酸
甘氨酸	75	10	0.133	0.40
L-精氨酸	174	200	1.15	0.483
L-天冬酰胺	132	50	0.379	-
L-天冬氨酸	133	20	0.150	-
L-胱氨酸2HCl	313	65	0.208	0/0.2
L-谷氨酸	147	20	0.136	-
L-谷氨酰胺	146	300	2.05	2
L-组氨酸	155	15	0.0968	0.27
L-羟基脯氨酸	131	20	0.153	-
L-异亮氨酸	131	50	0.382	0.8
L-亮氨酸	131	50	0.382	0.8
L-赖氨酸盐酸盐	146	40	0.274	1.0
L-甲硫氨酸	147	15	0.101	0.2
L-苯丙氨酸		15	0.0909	0.4
L-Proline	115	20	0.174	-
L-丝氨酸	105	30	0.286	0.4
L-苏氨酸	109	20	0.168	0.8
L-色氨酸	204	5	0.0245	0.078
L-酪氨酸二钠盐二水合物	261	29	0.111	0.4
L-缬氨酸	117	20	0.171	0.8
维生素
生物素	244	0.2	0.000820
氯化胆碱	140	3	0.0214	0.0285
D-泛酸钙	477	0.25	0.000524	0.008
叶酸	441	1	0.00227 /	0.009
i-肌醇	180	35	0.194	.04
烟酰胺	122	1	0.00820	0.033
对氨基苯甲酸	137	1	0.00730
盐酸吡哆醇	206	1	0.00485	.019
核黄素	376	0.2	0.000532	.001
盐酸硫胺素	337	1	0.00297	.012
维生素B12	1,355	0.005	0.0000037	-
无机盐
硝酸钙（Ca（NO 3）2）2·6H 2 O·6H 2 O）·/·	236	100	0.424
硫酸镁（MgSO 4）（无水）	120	48.84	0.407
氯化钾（KCl）	75	400	5.33
碳酸氢钠（NaHCO 3）	84	2,000	23.81	44
氯化钠（NaCl）	58	6,000	103.45
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）2/7H 2 O 3）	268	1,512	5.64
其他组件
谷胱甘肽（还原）		1	0.00326
酚红	376.4	5	0.0133

10x PBS
试剂来源在材料部门
中给出 80克NaCl
2克KCl
14.4g Na 2 HPO 4无水
2.4g KH 2 PO 4水溶液
溶于950ml 18Mohm水中，pH至7.4，换至1L，无菌过滤器（0.2μm）
0.2％的13 C 6葡萄糖，2mM的12 C-Gln（100ml）的培养基组成。
89.2ml基本培养基减去示踪剂（例如无葡萄糖的版本）（89％营养物浓度）
10ml无菌过滤的透析的FBS（10％FBS）在PBS（最终10.75mM葡萄糖）中的0.8ml 25％无菌过滤的13 C 6葡萄糖（0.2μm）
1ml 100x链霉素/青霉素原液
用于0.2％葡萄糖，2mM葡萄糖，2mM葡萄糖，2mM葡萄糖，2mM葡萄糖，2mM葡萄糖，2mM葡萄糖，/sub> -Gln（100ml）
88 ml基础培养基减去示踪剂（不含谷氨酰胺的版本）（所有营养物的88％浓度） 10ml无菌过滤的透析的FBS（10％FBS）在PBS中的1ml 0.2M无菌过滤的<15> 15，<15>，15 N 2 - 谷氨酰胺（0.2μm） 2 mM final）
1ml 100x链霉素/青霉素原液
对于激素敏感组织，可以使用活性炭剥离的FBS。
对于其他浓度的FBS，相应地调整FBS和基础培养基的体积注意：应将谷氨酰胺储备液制成新鲜或以-20℃小份储存，以避免反复冻融。它在溶液中储存时形成焦谷氨酸，甚至在中性pH和更高的温度下

致谢

这项工作部分由以下授权支持：NIH P01 CA163223-01A1，NIH 5R01ES022191-04，NIH 3R01ES022191-04S1，NIH 1U24DK097215-01A1和肯塔基挑战挑战赛。该协议是基于Xie et al。（2014）中描述的工作开发的;卖方（2015）和Bousamra （2012）。作者声明没有利益冲突。

参考文献

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