材料和试剂

1ml dounce组织研磨机（Capitol scientific，Wheaton ，目录号：357538）
5ml和60ml注射器（BD，Plastipak，目录号：309647和300866）
尼龙网过滤器100μm（Merck Millipore Corporation，目录号：NY1H02500）
Mitex膜过滤器10μm（Merck Millipore Corporation，目录号：LCWP02500）
1.5ml Eppendorf管（Eppendorf，目录号：0030120086）
C57BL/6小鼠（≥8周龄，雄性或雌性）（Mus musculus）
氯化钙（CaCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：C5670）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9333）
磷酸钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P3786）
碳酸氢钠（NaHCO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：71630）
氯化镁（MgCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
D - （+） - 葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：67528/G6728）
HEPES（pH7.4）（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
原钒酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：S6508）
氟酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：S7920）
焦磷酸钠十水合物（Sigma-Aldrich，目录号：221368）
甘油磷酸二钠盐水合物（Sigma-Aldrich，目录号：G6501）
抑肽酶（Sigma-Aldrich，目录号：A1153）
盐酸亮肽素（Sigma-Aldrich，目录号：L0649）
胃酶抑素（Sigma-Aldrich，目录号：P4265）
苯甲基磺酰氟（Sigma-Aldrich，目录号：78830）
Phospho-S845-GluR1 [抗磷酸-GluR1（Ser845）抗体，克隆EPR2148，兔单克隆]（Merck Millipore Corporation，目录号：04-1073）
磷酸-T185/Y187-ERK2 [Phospho-p44/42MAPK（Erk1/2）（Thr202/Tyr204）]（Cell Signaling Technology，目录号：9101）
Phospho-S235/236-rpS6（Cell Signaling Technology，目录号：2211）
Phospho-S209-eIF4E（Cell Signaling Technology，目录号：9741）
β-肌动蛋白[AC-15]（Abcam，目录号：AB6276）
突触单体缓冲液（参见配方）

设备

Swinnex过滤器保持器（Merck Millipore Corporation，目录号：SX0002500）
4oCEppendorf台式离心机

程序

注意：这种技术已经用于评估在纹状体的synaptoneurosome制剂中的药理学治疗后的生物化学变化（Biever等人，2015）。然而，相同的协议可以应用于其他大脑区域或行为范式之后。

通过颈椎脱位或断头杀死小鼠，并迅速将头部浸泡在液氮中4秒，以快速冷却大脑，而不允许它冻结（这一步有助于大脑解剖和更好地保持蛋白磷酸化）。我们建议使用物理方法例如颈椎脱臼，而不是使用麻醉剂或二氧化碳来安乐死小鼠，但这一步应该适应当地的伦理委员会指南。
去除大脑，去除脑膜，并在冰冷的玻璃盘上剖开2个半球的纹状体（≈15-20mg），如视频1所示。

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视频1.纹理提取

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在玻璃dounce匀浆器（10个松散杵，随后紧10杵的紧杵）与1毫升synaptoneurosome缓冲液保持在冰上均化纹理。中风的数量可以根据个体均化器/杵和脑区的大小而变化。所有步骤在4℃下进行（在冰上或在4℃室中）。每个步骤的匀浆的代表性图片如图1所示
将匀浆转移到Eppendorf管中，并等分100μl作为输入
准备如图2所示的synaptoneurosome准备程序所需的所有材料。
在冰上的synaptoneurosome缓冲液中预湿3尼龙网过滤器（100μm孔）
将没有柱塞（注射器＃1）的5ml注射器连接到含有3个预润湿的尼龙网过滤器（100μm）的swinnex过滤器保持器（＃1），如图3所示。然后，将该swinnex连接到另一个5 ml注射器（注射器＃2），其已经在分配末端附接到含有1 Mitex膜过滤器（10μm孔）（swinnex过滤器保持器＃2）的swinnex过滤器支架上。将位于swinnex＃2另一侧的1.5 ml Eppendorf管置于冰上收集样品。
用1-ml移液管将样品加载到连接到＃1的swinnex过滤器支架＃1的注射器＃1的筒的末端，插入柱塞并向下推到柱塞上，直到所有空气从注射器排出。 br />
取出5毫升注射器＃1，并用一个60毫升注射器替换它，柱塞被拉回。一旦连接到包含3个尼龙网过滤器（100μm）的swinnex过滤器支架＃1，向下推动柱塞，直到所有空气从注射器流出。此步骤有助于将样品下推到＃2注射器的筒体
取出含有3个尼龙网过滤器（100μm）的swinnex过滤器支架＃1，将连接到含有1 Mitex膜过滤器（10μm）的swinnex过滤器支架＃2的5ml注射器＃2的柱塞，向下推直到所有空气从注射器流出。
取下2号注射器，并用60毫升注射器替换它，柱塞被拉回。一旦连接到＃2的swinnex过滤器支架，向下推动柱塞，直到所有的空气从注射器流出。在该步骤中，匀浆应该置于置于冰上的1.5ml Eppendorf管中
在4℃下以4,000×g离心1分钟。吸取上清液到一个新的Eppendorf管中并丢弃沉淀。图1b示出了粒料如何看起来的代表性图像
在4℃下以14,000×g离心上清液4分钟。丢弃上清液和重悬在100μlsynaptoneurosome缓冲液沉淀。图1c中示出了粒料如何看起来的代表性图像。（根据所需的蛋白质浓度，重悬细胞沉淀的体积可能改变。从一只小鼠的纹状体获得的突触单体制剂具有约1-2μg/μl的蛋白质浓度。丸粒可以储存在-80℃直到使用。
注意：在这种类型的突触单体制备中，我们获得了包含突触前和突触后标记物的富集的样品，胶质标记物的显着减少和不存在核标记物（Biever等人，2015）。此外，可以检测磷蛋白，如图4所示。

代表数据

图1.匀浆在不同步骤的代表性图像。 a。如步骤3所示，一只小鼠纹状体均化后获得的样品。如步骤12所示在第一次离心后获得的样品。第二次离心后获得的样品，如步骤13所示。

在swinnex过滤器支架＃1中放置三个预润湿的尼龙网过滤器（100μm），在swinnex过滤器支架＃2中放置一个Mitex膜过滤器。以如下顺序从底部到顶部安装设备：在冰上的Eppendorf swinnex过滤器保持器＃ 5ml注射器＃2， swinnex过滤器保持器＃ 5毫升注射器＃1无柱塞。在用移液管将样品装载到＃1注射器的筒中之后，添加柱塞并向下推，直到所有空气从注射器排出。取出5毫升注射器＃1，并用一个60毫升注射器替换它，柱塞被拉回。一旦连接到swinnex过滤器支架＃1，向下推动柱塞，直到所有的空气从注射器流出。该步骤有助于将样品下推到注射器＃2的筒体。继续步骤10所示的协议。

图3.用于synaptoneurosome制备程序的安装设备的图示。将5ml注射器（注射器＃1）连接到含有3个尼龙网过滤器（100μm）（swinnex过滤器保持器＃ 1），并连接到另一个5ml注射器（注射器＃2），其连接到包含Mitex膜过滤器（10μm）（swinnex过滤器保持器＃2）的第二swinnex过滤器保持器。将1.5ml Eppendorf管放置在swinnex的另一侧的冰上，以收集最初装载到＃1注射器中的样品。
注意：根据样品量，注射器＃1和＃2可以用不同尺寸的注射器替换。

图4.纹状体synaptoneurosome制剂中磷蛋白的代表性蛋白质印迹。在电泳转移到Immobilon-P膜上之前，在13％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中分离10μg的每个通道的synaptoneurosomal样品。使用常规的蛋白质印迹方案，包括以下抗体：磷酸-S845-GluR1，磷酸-T185/Y187-ERK2，磷酸-S235/236-rpS6磷酸-S209-eIF4E和β-肌动蛋白。

致谢

这项工作由Inserm，Agence Nationale de la Recherche（授予ANR-2010-JCJC-1412至E.V.）和来自大脑和行为研究基金会（授予E.P.）的NARSAD年轻研究者授予的支持。 A. B.由Fonds National de la Recherche，Luxembourg（Grant 3977033）支持。 E.P.是在欧盟委员会（Grants EMBOCOFUND2010和GA-2010-267146）和Marie Curie欧洲团契IEF327648的支持下的EMBO奖学金的接受者。

食谱

突触体神经元缓冲液（使用高纯度的无菌水，如Milli-Q水）
2.5mM CaCl 2·h/v 124mM NaCl 3.2 mM KCl
1.06mM KH 2 PO 4 sub/
26mM NaHCO 3/v/v 1.3mM MgCl 2·h/v 10mM D - （+） - 葡萄糖 20mM HEPES（pH7.4） 0.15μM抑肽酶
11μM亮肽素
1.5μM胃酶素
0.6mM苯甲基磺酰氟 1 mM原钒酸钠*
100mM氟化钠*
5mM焦磷酸钠十水合物*
40mM磷酸甘油二钠盐水合物*
注意：缓冲区应该在实验当天准备好。如果在synaptoneurosome制剂中分析磷蛋白，则只需要用星号标记的缓冲液组分。

参考文献

Biever，A.，Puighermanal，E.，Nishi，A.，David，A.，Panciatici，C.，Longueville，S.，Xirodimas，D.，Gangarossa，G.，Meyuhas，O.，Herve， Girault，JA和Valjent，E。（2015）。核糖体蛋白S6的PKA依赖性磷酸化与纹状体和纹状体中等大小的翻译效率不相关spiny neurons。 J Neurosci 35（10）：4113-4130。
Bramham，C.R。和Wells，D.G。（2007）。 Dendritic mRNA：转运，翻译和功能。 Nat Rev Neurosci < 8（10）：776-789。
Buffington，S.A.，Huang，W。和Costa-Mattioli，M。（2014）。突触可塑性和认知功能障碍的平移控制。 Annu Rev Neurosci < 37：17-38。