通过热诱导迁移的分离 - 允许回收有活力的幼虫，但不是死亡或垂死的幼虫。
通过消化肺分离 - 允许死亡和活的幼虫的恢复。
通过支气管肺泡灌洗（BAL）分离 - 允许用于评估在其到肠道的途中的蜕皮4幼虫的数量。
这些协议可用于跟踪蠕虫在感染过程中的动态和宿主免疫系统对蠕虫生存力和繁殖力的影响。

第I部分：迁移隔离

材料和试剂

干酪布切成8 x 8厘米的方块（任何布料商店）
8×8cm塑料一次性称量舟（Medi'Ray-Laboratory，Runlab Archives，目录号：RL33102）
50ml离心管（Thermo Fisher Scientific，Falcon ^TM，目录号：352070/14-432-22）和相应的架子
一次性巴斯德移液管（Interab Supply，目录号：KJ619-1）
60×15mm TC皿（Thermo Fisher Scientific，Falcon ，目录号：353002/08-772B）
N。 brasiliensis 感染的小鼠（Camberis等人，2003）
70％乙醇
PBS（DPBS，无钙，无镁）（Life Technologies，Gibco ，目录号：14190-144）
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：14190-144"

设备

虹膜剪刀（Medicon，目录号：202.20.11）
钳（Medicon，目录号07.55.20）
水浴设置在37℃（Biolab，型号：Grant SUB Aqua 18），水的深度距离50ml管的顶部不超过2cm
立体显微镜（奥林巴斯，型号：SZX16）

程序

通过加入45毫升PBS到50毫升管中准备迁移管。在37°C水浴中保温，直到准备使用。
安乐死受感染的小鼠颈椎脱位或任何批准形式的安乐死
将鼠标放在其背部，用70％乙醇湿润
暴露胸腔;取出肺并置于干净的一次性称量船中

图1.来自N的第2天的肺。（由白色箭头指示的幼虫进入肺部造成的血肿斑）感染的小鼠
使用剪刀将肺切成约1-2mm的细组织片
将8×8厘米的粗棉布放入准备好的50ml管中，使布的边缘悬挂在容器的侧面;这应该在管中形成开口袋（图2a）
将切成小块的肺转移到准备好的50ml管的小袋中（图2b）。
取出干酪布的暴露边缘，并以这样的方式关闭袋，暴露的干酪边缘悬挂在50ml管的边缘（图2c）。用盖子密封管子，以便将布的边缘卡在盖子下（图2d）。
置于水浴中，在37℃下孵育至少3小时或在水浴中孵育过夜注意：确保至少三分之二的管浸没在水中，因为幼虫通过跟随热梯度从组织迁移出来并且沉积在管的底部。

图2.用于热梯度诱导迁移/分离/计数受感染组织幼虫的管道
在孵育期后弃去干酪包布。
注意：蠕虫将通过组织迁移并收集在50ml管的底部。
在不破坏沉淀的情况下，通过用塑料一次性移液管抽吸除去2至3ml的PBS而丢弃。
将管的内容物转移到60×15mm TC皿中，并使用立体显微镜观察幼虫。
注意：超过3毫升的体积可能会使幼虫困难。

第二部分。肺消化隔离

材料和试剂

50ml离心管（Thermo Fisher Scientific，Falcon ^TM，目录号：352070/14-432-22）和相应的架子
6孔组织培养皿（Thermo Fisher Scientific，Falcon ，目录号：353046/08-772-1B）
100μm细胞过滤器（Thermo Fisher Scientific，Falcon ，目录号：352360/22-363-549）
40μm细胞过滤器（Thermo Fisher Scientific，Falcon ，目录号：352340/22-363-547）
一次性巴斯德移液管（InterLab Supply，目录号：KJ619-1）
N。 brasiliensis 感染的小鼠（Camberis等人，2003）
70％乙醇
PBS（DPBS，无钙，无镁）（Life Technologies，Gibco ，目录号：14190-144）
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：14190-144"
Liberase ^TM TL Research Grade（Sigma-Aldrich，目录号：5401020001）
DNase I（Sigma-Aldrich，目录号：10104159001）
IMDM，GlutaMAX ^TM Supplement（Life Technologies，Gibco ^TM，目录号：31980-030）
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：31980-030"
消解混合（参见配方）

设备

虹膜剪刀（Medicon，目录号：202.20.11）
钳（Medicon，目录号：07.55.20）
立体显微镜（奥林巴斯，型号：SZX16）
孵育器摇床/摇床（Eppendorf，New Brunswick Scientific，型号：innova 4200）设定为37℃

程序

安乐死小鼠颈椎脱位或任何批准形式的安乐死。
将鼠标放在其背部，用70％乙醇湿润
暴露胸腔;取出肺并放入6孔培养皿的孔中
使用剪刀将肺切成约1-2毫米的细小组织
向每个孔中加入5ml消解混合物，并通过旋转板轻轻混合
在37℃下在振荡培养箱中缓慢搅拌孵育45分钟
使用一次性移液管，将肺消化物转移到连接到50ml管的100μm细胞过滤器。用5ml IMDM冲洗孔并转移到细胞过滤器
使用一次性移液管将管的内容物转移到附接到另一个50ml管的40μm细胞过滤器。
注意：这将肺组织与幼虫分离，幼虫停留在过滤器的顶部。
将40μm过滤器转移到6孔TC培养皿中，并将40μm过滤器上下颠倒
使用一次性移液管冲洗5ml IMDM，以移出捕获在细胞滤网上的幼虫。使用立体显微镜检查细胞过滤器是否存在幼虫，如有必要再次冲洗
使用立体显微镜可视化幼虫。

第三部分。支气管肺泡灌洗（BAL）隔离

该方案已经改变自用于测量过敏性气道炎症的方案（Harris等人，1997; Erb等人，1998）。

材料和试剂

1ml滑动唇形注射器（BD，目录号：302100）
18 G Insyte导管（BD，目录号：381247）
15ml锥形离心管（Thermo Fisher Scientific，Falcon ^{TM，目录号：352096/14-959-49B）和相应的架子}
60×15mm TC皿（Thermo Fisher Scientific，Falcon ，目录号：353002/08-772B）
N。 brasiliensis 感染的小鼠（Camberis等人，2003）
70％乙醇
PBS（DPBS，无钙，无镁）（Life Technologies，Gibco ，目录号：14190-144）
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：14190-144"

设备

虹膜剪刀（Medicon，目录号：202.20.11）
钳（Medicon，目录号07.55.20）
立体显微镜（奥林巴斯，型号：SZX16）

程序

安乐死的小鼠颈椎脱位（或任何批准形式的安乐死），但注意保持气管的完整性。
将鼠标放在其背部，用70％乙醇湿润
做一个中线切口，拉回皮肤，通过小心地分离气管上方的肌肉组织暴露气管（图3a）。
在暴露的气管上做一个小的水平切口，不要直接通过气管（图3b和图3c）。
将18 G Insyte导管连接到1 ml注射器，并加入1 ml PBS
将导管插入气管约10 mm，并将注射器的内容冲洗到肺部（图3d）。
抽出流体（图3e），将注射器的内容物放入15ml管中由于幼虫进入肺部造成的损害，灌洗液将被血液污染。为了改善幼虫在灌洗液被血液污染时的可视化，将BAL液以1400rpm离心2分钟，除去上清液，通过向沉淀中加入3ml水溶解红细胞，然后计数幼虫。蜕皮4幼虫的区别特征是沉积在肠中清楚可见的深棕色色素（Bouchery等人，2015）。
每次灌洗时，用新鲜PBS重复两次。
通过将灌洗液转移到60×15mm TC皿中并使用立体显微镜检查内容来观察幼虫。

图3.进行支气管肺泡灌洗的实验程序

代表数据

图4.使用热梯度诱导的迁移，支气管肺泡灌洗（BAL）或肺消化来自肺的幼虫恢复的比较。

笔记

对于使用上述方案的一致结果，重要的是总是使用来自2-6周龄培养物的幼虫感染小鼠。在培养6周后，幼虫的感染性大大降低（Camberis等人，2003; Kassai，1982）。

食谱

消化混合物
0.1mg/ml Liberase TL
120mg/ml DNase I在IMDM中制成
补充新鲜，足够5毫升/肺

致谢

这项工作已经改编和修改，从前由Graham Le Gros的过敏和寄生虫疾病实验室，新西兰Malaghan医学研究所进行的工作。这项工作得到了新西兰健康研究委员会和Marjorie Barclay信托的支持。

参考文献

Bouchery，T.，Kyle，R.，Camberis，M.，Shepherd，A.，Filbey，K.，Smith，A.，Harvie，M.，Painter，G.，Johnston，K.，Ferguson， Jain，R.，Roediger，B.，Delahunt，B.，Weninger，W.，Forbes-Blom，E.and Le Gros，G.（2015）。 ILC2和T细胞合作以确保M2巨噬细胞维持针对钩虫的肺免疫。 Nat Commun 6：6970.
Camberis，M.，Le Gros，G。和Urban，J.，Jr。（2003）。巴西尼日利亚动物模型和Heligmosomoides polygyrus。 < em> Curr Protoc Immunol 第19章：单位19 12。
Erb，K.J.，Holloway，J.W.，Sobeck，A.，Moll，H。和Le Gros，G。（1998）。感染小鼠与分枝杆菌牛 - 卡介苗（BCG）抑制变应原诱导的气道嗜酸粒细胞增多。 J Exp Med 187（4）：561-569。
Harris，N.，Campbell，C.，Le Gros，G。和Ronchese，F。（1997）。 mCTLA4-Hgamma1阻断CD28/B7共刺激抑制抗原诱导的肺嗜酸性粒细胞增多，但不抑制Th2细胞发育或在肺中的募集。 Eur J Immunol 27（1）：155-161。
Harvie，M.，Camberis，M.，Tang，S.C.，Delahunt，B.，Paul，W。和Le Gros，G。（2010）。肺是预防胃肠蠕虫寄生虫的CD4 T细胞介导的保护性免疫的重要位点。 Infect Immun 78（9）：3753-3762。
Kassai，T。（1982）。 "Nippostrongylus brasiliensis 手册，Akademia Kiado，Budapest，ISBN-10：9630529769.