材料和试剂

50ml锥形管（Sarstedt AG& CO，目录号：62.547.004）
100mm组织培养皿（Corning，目录号：430167）
0.22μm过滤单元（Genesee Scientific Corporation，目录号：25-227）
电池升降器（Corning，目录号：3008）
大肠杆菌BL21（New England Biolabs，目录号：C2530H）
pGEX-5X-3（GE Healthcare，目录号：27-4586-01）
pGEX5X3-Happl1（aa 5-419）（自制）（Jean 等人，2015）
pAcEGFP-C1载体（Clontech，目录号：632470）
pEGFP-C1：RAB21野生型[克隆在pAcEGFP-C1中的人类RAB21（此构建体用于产生稳定的HeLa M细胞系）]（自制）（Jean等人，2015） br />
EGFP：RAB21wt（野生型）稳定转染的HeLa M细胞（自制）（Jean 等，2015）
异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）（Biopioneer，目录号：c0012）
氨苄青霉素钠盐（结晶粉末）（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP176025）
BD Bacto ^TM胰蛋白胨（Thermo Fisher Scientific，目录号：DF0123173）
酵母提取物（Thermo Fisher Scientific，目录号：212750）
谷胱甘肽琼脂糖4B珠（GE Healthcare，目录号：17-0756-01）
蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich，目录号：P8340-5）
胎牛血清（Sigma-Aldrich，目录号：F2442-500ml）
青霉素 - 链霉素溶液（Life Technologies，目录号：15140-122）
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：15140-122"
胰蛋白酶-EDTA（0.25％），酚红（Life Technologies，目录号：25200-056）注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：25200-056"
0.4％台盼蓝（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：15250-061）
注意：目前，"赛默飞世尔科技，Gibco ^TM <目录号：15250-061"
鸟苷5'-三磷酸钠盐水合物（Sigma-Aldrich，目录号：G8877-25mg）
0.5M液体EDTA（Cell growth，目录号：45001-122）
注意：目前，它是"VWR国际，目录号：45001-122"。
Earl's平衡盐溶液（用碳酸氢钠，不含酚红液，无菌过滤）（Sigma-Aldrich，目录号：E3024-500ml）
二硫苏糖醇（VWR International，目录号：IB21040）
HEPES（Thermo Fisher Scientific，Biotech，目录号：BP310-100）
IGEPAL CA-630（Sigma-Aldrich，目录号：I8896-100ml）
甘油（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP229-1）
氯化镁六水合物（MgCl 2·6H 2 O·6H 2 O）（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP214-500）
原钒酸钠（Na 3 VO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：S6508-10g）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100-500ml）
氯化钠（NaCl）（Thermo Fisher Scientific，目录号：S671-3）
氯化钾（KCl）（VWR International，目录号：BDH9258-500g）
磷酸氢二钠无水（Na 2 HPO 4）（Thermo Fisher Scientific，目录号：S374500）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Thermo Fisher Scientific，目录号：P285-S500）
具有高葡萄糖与4mM L-谷氨酰胺和丙酮酸钠的Dubelcco改良Eagle培养基（GE Healthcare，Hyclone ^TM，目录号：SH30243.FS）（参见完全DMEM的配方）
抗GFP（B2）抗体（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-9996）
Luria Broth（请参阅食谱）
LB /氨苄青霉素（见配方）
完成DMEM（参见配方）
1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）（参见配方）
1 M HEPES（pH 7.5）（参见配方）
5 M NaCl（见配方）
1 M MgCl <2> （参见配方）
0.2 M原钒酸钠（参见配方）
25 mM GTP（参见配方）
改性镁裂解缓冲液（MLB）（参见配方）

设备

移液管10μl，100μl和1000μl（Eppendorf，目录号：3120000020,312000046和31200000623）
Sonifier ^?细胞破坏剂（VWR International，目录号：CA33995-320）
37℃摇床[类似于New Brunswick Excella E25（Eppendorf，New Brunswick Scientific，目录号：M1353-0002）]
30℃摇床[类似于New Brunswick Excella E25（Eppendorf，New Brunswick Scientific，目录号：M1353-0002）]
组织培养生物安全柜[类似于Thermo Scientific 1300 Series Class II（Thermo Fisher Scientific，目录号：1323）]
血细胞计数器（VWR International，目录号：100498-470）
离心机（Eppendorf，目录号：5804R）
台式离心机（Eppendorf，目录号：5415D）
旋转轮（Barnstead Thermolyne Lab Quake Shaker Rotisserie）
超声波仪，Branson超声波仪S250A模拟超声波细胞破碎仪（Thermo Fisher Scientific，目录号：22309782）

程序

GST：APPL1（含有PH结构域，PTB结构域和亮氨酸拉链基序的衔接蛋白）细菌表达
1. 使用无菌技术，敲击E的LB-氨苄青霉素培养皿。用pGEX5X3-hAPPL1（aa 5-419）转化的大肠杆菌 BL21 ，并在37℃ 过夜（o/n）。板应在1周内使用最大蛋白表达。
2. 从中风板接种一个菌落的100毫升LB /氨苄青霉素。在37℃o/n下连续搅拌下生长。
3. 以4,000×g离心O/n培养物10分钟。
4. 将沉淀重悬在50ml LB /氨苄青霉素中，并与950ml LB /氨苄青霉素混合。
5. 在30℃下在搅拌下培养培养物直到OD 600为0.8 达到，通常90分钟，然后诱导表达的GST：hAPPL1 （5-419），通过加入终浓度为1mM IPTG。孵育3小时在30℃下在恒定搅拌下。
6. 诱导后，通过在4℃以4,000×g离心10分钟来分离细胞。洗涤沉淀 ?一次用50ml的1x PBS。通过离心再次沉淀细胞。取出PBS，并在-80°C冻结沉淀或继续前进纯化。
GST：APPL1（5-419）纯化
1. 重悬细菌在25毫升冰冷的1×PBS含有1×蛋白酶抑制剂混合物和1mM DTT，并将细胞悬浮液转移至 ?50ml锥形管。
2. 超声处理四次，每次45秒在100％占空比和在输出4（使用Branson超声波仪）。确保在每次超声处理之间冷却样品。
3. 向细菌裂解物中加入2.5ml 10％Triton X-100/PBS溶液，最终Triton浓度为1％。
4. 超声处理1次以上。
5. 为了沉淀细菌碎片，在4℃下以12,000xg离心20分钟。
6. 在离心过程中，准备谷胱甘肽琼脂糖4B珠：
  1. 吸取800微升谷胱甘肽珠进入离心管。
  2. 在台式离心机中在室温下以12,000xg离心珠离心30秒。
  3. 取出上清液，加入1 ml 1×无菌PBS。重悬谷胱甘肽Sepharose 4B珠。
  4. 重复步骤B6b-c两次。
  5. 最后一次洗涤后，重悬在500μl1×PBS中的谷胱甘肽琼脂糖4B珠。
  6. 将重悬的谷胱甘肽Sepharose 4B珠转移到50ml锥形管中。
7. 离心细菌裂解液后，倒入上清液进入含有制备的谷胱甘肽的50ml锥形管中 Sepharose 4B珠。避免转移任何 E。大肠杆菌粗品。
8. 至避免GST降解：APPL1在室温孵育过程中，向浆液中加入250μl100x蛋白酶抑制剂混合物。
9. 在室温下轻微搅拌孵育20分钟。
10. 在4℃下在台式离心机中以4,000xg离心浆液3分钟。
11. 取出上清液，并重悬于Glutathione Sepharose 4B珠在45毫升1×冰冷PBS中。
12. 重复步骤B10-11四次。
13. 最后一次洗涤后，取出大部分1x PBS。转移浆料 ?到Eppendorf管，并评估其质量和数量纯化的蛋白通过常规SDS-PAGE电泳，随后考马斯染色（图1）。我们建议使用越来越多的 GST：APPL1浆液以评估纯度（1μl，5μl，10μl和20μl 该浆料将覆盖大范围的蛋白质浓度）。串行 BSA稀释系列可用于定量。
14. 商店珠子在4℃。 GST：APPL1珠在其使用后的同一个月制备和实验成功地重复了一个月。但是，我们没有测试更长的存储时间
  
  图1.纯化的GST的Coomasie染色的PVDF膜：APPL1
GFP：RAB21wt HeLa细胞培养和自噬诱导
1. 从100mm股票GFP：RAB21wt细胞培养板中删除媒体，并用5ml的1×PBS洗涤。
2. 取出PBS，加入1ml 0.25％胰蛋白酶-EDTA，然后在37℃孵育3分钟。
3. 用10ml完全DMEM洗涤板上的细胞。
4. 吸取20微升的细胞悬液，并加入100微升的台盼蓝溶液。
5. 吸取10微升的这个单元格/台盼蓝稀释到血细胞计数室。
6. 在标准显微镜上使用血细胞计数器计数活细胞。活细胞将是台盼蓝阴性。
7. 每100mm培养皿中加入总共5×10 5个细胞（每个时间点需要1个培养皿）。
8. 用完全DMEM使每个培养皿达到8ml，并移至37℃培养箱过夜（o/n）。
9. 为了引起饥饿诱导的自噬，用5毫升预热的EBSS洗涤细胞1×。
10. 取出EBSS，加入8 ml预热的EBSS。孵化为期望的时间量（GFP：Rab21wt HeLa细胞的典型时间点，为0,5,15,30和60分钟）。缓解后续操作，首先从最长的时间点开始，使所有的可以同时处理不同的时间点。
RAB21活性测定
1. 转移细胞在冰上，用冰冷的1×PBS洗涤细胞两次。
2. 除去PBS，并溶解细胞在800μl冰冷的修改MLB缓冲区。 ?使用细胞提升器和转移细胞从细胞板刮下细胞裂解物至1.5ml Eppendorf管。
3. 孵育细胞裂解物在冰上20分钟。
4. 在4℃下以16,100×g离心细胞裂解物10分钟。
5. 在离心过程中，准备用于实验的GST：APPL1珠子：
  1. 重悬GST：APPL1珠，并移取适当的体积进入新的1.5ml Eppendorf管。 4μgGST：每个时间点需要APPL1， ?因此如果测试5个时间点并且GST：APPL1在a 浓度为160ng /μl，则需要25μl的GST：APPL1 管。
  2. 在4℃下，以11,000×g离心GST：APPL1珠30秒。
  3. 除去上清液，加入1ml改性MLB缓冲液。
  4. 重复步骤D5b-c两次。
  5. 除去上清液。
6. 对于每个时间点，添加700微升GFP：RAB21wt HeLa细胞上清液至制备的珠。如果比较不同的细胞系， ?必须测量每种细胞系裂解物的蛋白质总量并调节以使等量的蛋白质孵育 GST：APPL1。
7. 在4℃下在旋转轮上孵育1小时。
8. 每个管在室温下以11,000×g离心30秒
9. 取出上清液，加入1ml冰冷的改性MLB缓冲液。
10. 重复步骤8和9三次（总共四次洗涤）。
11. 通过加入30μl的2x SDS-PAGE上样缓冲液从珠子洗脱结合的蛋白质，并在95℃加热5分钟。
12. 通过使用针对GFP的抗体的western印迹分析来分析结果（图2）。
  
  图2.GFP：RAB21活性测定的典型结果剥夺，GFP：RAB21被瞬时激活。 GFP：RAB21-GTP 通过GST：APPL1下拉检测。总RAB21代表细胞中的RAB21 裂解物。用抗GFP检测RAB21总和和RAB21-GTP 免疫印迹。

食谱

Luria肉汤（LB）
混合10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克NaCl
加入1升水
充分混合并在121℃高压灭菌30分钟
LB /氨苄青霉素
向1L LB中加入1ml氨苄青霉素储备液（50mg/ml）
完成DMEM
从购买的500 ml HyClone瓶中取出55 ml DMEM
加入50ml胎牛血清
加入5ml青霉素/链霉素溶液
使用过滤装置过滤灭菌
1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）
将8g的NaCl，0.2g的KCl，1.44g的Na 2 HPO 4和0.24g的KH 2 PO 4
加入900ml dH 2 O
将pH调节至7.4
将最终体积调整为1,000 ml
在121℃高压灭菌20分钟，灭菌处理
1 M HEPES（pH 7.5）
将238.3g HEPES在900ml水中混合
用NaOH调节pH至7.5 调整到1000毫升
在121℃高压灭菌20分钟，灭菌处理
5 M NaCl
将292g NaCl溶于800ml水中
调整到最终体积为1000毫升
在121℃高压灭菌20分钟，灭菌处理
1 M MgCl 2
在700ml水中溶解203g的MgCl 2·6H 2 O·6H 2·6H 2 O< br / 调整到最终体积为1000毫升
在121℃高压灭菌20分钟，灭菌处理
0.2 M原钒酸钠在100ml水中溶解3.68g Na 3 VO 4溶液
涡旋和等分用于存储
储存于-20°C
25 mM GTP
将0.13g GTP加入10ml水中
使用0.2μm过滤器过滤，并存放等份
储存于-20°C
修改MLB缓冲区
加入50ml水
2.5ml 1M HEPES（pH7.5）储液
3ml 5M NaCl储备液
加入2ml的1M MgCl 2·h/v 10ml甘油 1ml IGEPAL CA-630
0.2ml 0.5M EDTA
加入0.5ml的0.2M Na 3 VO 4子/ 0.1ml 25mM GTP储液（以保持RAB21处于其活化状态）
储存于-20°C

致谢

RAB21活性测定改变自先前公开的研究（Franco等人，2014; Mai等人，2011; Zhu等人，，2007），并在（Jean等人，2015年）中进行。这项工作是由FRSQ，AHA和CRS博士后研究支持SJ和NIH RO1 GM078176和从SDCSB NIH P50 GM085764到AAK的支持。

参考文献

Franco，I.，Gulluni，F.，Campa，CC，Costa，C.，Margaria，JP，Ciraolo，E.，Martini，M.，Monteyne，D.，De Luca，E.，Germena，G.，Posor ，M。，Maffucci，T.，Marengo，S.，Haucke，V.，Falasca，M.，Perez-Morga，D.，Boletta，A.，Merlo，GRand Hirsch， PI3K II类α控制空间限制性内体PtdIns3P和Rab11活化以促进原发性纤毛功能。 Dev Cell 28（6）：647-658。
Jean，S.，Cox，S.，Nassari，S.and Kiger，A.A。（2015）。饥饿诱导的MTMR13和RAB21活性调节VAMP8以促进自噬体 - 溶酶体融合。 em> EMBO Rep 16（3）：297-311。
Mai，A.，Veltel，S.，Pellinen，T.，Padzik，A.，Coffey，E.，Marjomaki，V。和Ivaska，J。 Rab21和p120RasGAP与整联蛋白的竞争性结合调节受体传导和迁移。 J Cell Biol 194（2）：291-306。
Zhu，G.，Chen，J.，Liu，J.，Brunzelle，JS，Huang，B.，Wakeham，N.，Terzyan，S.，Li，X.，Rao，Z.，Li，，XC（2007）。 APPL1 BAR-PH结构域及其与Rab5的相互作用的特征描述。 em> EMBO J 26（14）：3484-3493