材料和试剂

Costar ^? 24透明TC处理孔板（Corning，目录号：3526）
＃1.5圆玻璃盖玻片（Ted Pella，目录号：260368）
100mm组织培养皿（Corning，目录号：430167）
0.22μm过滤单元（Genesee Scientific Corporation，目录号：25-227）
HeLa细胞（ATCC，目录号：CCL-2）
JetPRIME（Polyplus转染，目录号：114-07）
pCDNA3-VAMP8-3xHA表达质粒（自制）（Jean ，2015）
具有高葡萄糖与4mM L-谷氨酰胺和丙酮酸钠的Dulbecco改良的Eagle培养基（GE Healthcare，Hyclone ^TM，目录号：SH30243.FS）（参见完全DMEM的配方）
胎牛血清（Sigma-Aldrich，目录号：F2442-500ml）
青霉素 - 链霉素溶液（Life Technologies，目录号：15140-122）
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：15140-122"
胰蛋白酶-EDTA（0.25％）（Life Technologies，目录号：25200-056）
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：25200-056"
0.4％台盼蓝（Life Technologies，目录号：15250-061）注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：15250-061"
兔抗HA抗体（Abcam，目录号：ab9110）
Earl's平衡盐溶液（用碳酸氢钠，不含酚红，液体，无菌过滤）（Sigma-Aldrich，目录号：E3024-500ml）
牛血清白蛋白（级分V，热休克处理）（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP1600-100）
氯化钠（NaCl）（Thermo Fisher Scientific，目录号：S671-3）
氯化钾（KCl）（VWR International，目录号：BDH9258-500g）
磷酸氢二钠无水（Na 2 HPO 4）（Thermo Fisher Scientific，目录号：S374500）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Thermo Fisher Scientific，目录号：P285-S500）
多聚甲醛（Thermo Fisher Scientific，目录号：AC41678-5000）
山羊精华（Life Technologies，目录号：16210-064）
注意：目前，"赛默飞世尔科技，Gibco ^TM ，目录号：16210-064"
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100-500ml）
小鼠抗人类Lamp1（Developmental Studies Hybridoma Bank，目录号：H4A3）
小鼠抗EEA1（BD Biosciences，目录号：610457）
山羊抗小鼠IgG（H + L）二抗，Alexa Fluor <488缀合物（Life Technologies，目录号：A-11029）
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM
山羊抗兔IgG（H + L）第二抗体，Alexa Fluor 546缀合物（Life Technologies，目录号：A11035）
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^/>
[4'，6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐]（DAPI）（Life Technologies，目录号：D1306）
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^TM ，目录号：D1306" br />
FluorSave试剂（Merck Millipore Corporation，Calbiochem ，目录号：345789）
完成DMEM（参见配方）
1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）（参见配方）
4％多聚甲醛溶液（参见配方）
阻止缓冲区（参见配方）
抗体孵育缓冲液（参见配方）

设备

37℃，5％CO 2细胞培养箱[类似于Thermo Scientific Heracell VIOS 160i CO 2培养箱（Thermo Fisher Scientific，目录号：51030285）]。 >
组织培养生物安全柜[类似于Thermo Scientific 1300 Series Class II（Thermo Fisher Scientific，目录号：1323）]
血细胞计数器（VWR International，目录号：100498-470）
移液管10μl，100μl和1000μl（Eppendorf，目录号：3120000020,312000046和31200000623）
真空瓶（自制）
注意：在免疫荧光方案期间需要从24孔板中去除培养基。
微量离心机（Eppendorf，目录号：5415D）

程序

第1天：播种细胞
1. 在24孔板的每个孔中加入1个圆形无菌盖玻片。使用无菌镊子操纵封面眼镜。（使用的井数取决于样品的数量和时间点）。封面是在玻璃皿中高压灭菌30分钟
2. 去掉来自100mm股票HeLa板的培养基，并用5ml 1x PBS洗涤。或者 ?室温或37℃预热的PBS适合于这些步骤列在程序A中。
3. 取出PBS，加入1ml 0.25％胰蛋白酶-EDTA，37℃孵育3分钟。
4. 用10ml完全DMEM洗涤板上的细胞。
5. 吸取20微升的细胞悬液，并加入到100微升的锥虫蓝溶液在Eppendorf管中。
6. 吸取10微升的这个单元格/台盼蓝稀释到血细胞计数室。
7. 在标准显微镜上使用血细胞计数器计数活细胞。活细胞将是台盼蓝阴性。
8. 在24孔板的每孔中加入总共1.5×10 4个细胞。
9. 每孔加入1.5ml完全DMEM，并移至37℃培养箱过夜（o/n）。
第2天：HeLa细胞使用JetPrime转染
1. 从每个孔中删除培养基，并更换为0.5毫升的完整DMEM。
2. 在1.5ml Eppendorf管中，加入500ng的pCDNA3-VAMP8-3xHA和用JetPrime缓冲液调节至终体积为100μl。大量的 DNA，JetPrime缓冲区和JetPrime就足够了转染24孔板的6个孔。这可以按比例放大或取决于所需的井数
3. 涡旋10秒，并在微量离心机中以1,000rpm离心5秒。
4. 加入2μl的JetPrime转染试剂。
5. 涡旋10秒，并如步骤B3中旋转。
6. 在室温下孵育至少10分钟。
7. 每孔加入15μl转染混合物。每个主混合物可用于6口井
8. 在37℃下在组织培养箱中孵育6小时。
9. 取出介质，并更换为1.5毫升完整的DMEM。
10. 在37℃组织培养箱中孵育过夜。
第3天：VAMP8内吞摄取测定
1. 用1ml冰冷的DMEM洗涤转染的细胞。重复一次，共两次洗涤。删除所有介质。
2. 在冰冷的完全DMEM中稀释兔抗HA抗体至1:200的最终稀释度。
3. 向每个孔中加入150μl稀释的抗-HA抗体。
4. 在冰上孵育60分钟，偶尔摇摆。（这一步允许抗体与质膜定位的VAMP8的结合）。
5. 用1ml冰冷的完全DMEM洗涤细胞三次。（该步骤除去所有未结合的抗体）。
6. 用1ml预热的EBSS（37℃）洗涤细胞两次。
7. 向每个孔中加入1ml预热的EBSS，并在37℃下孵育组织培养孵育15,45和90分钟。请参考 section，'重要的实验控制摄取测定验证，以便准备所有必要的控制。
免疫荧光（第3天和第4天）
1. 在每个时间点，取出适当的盖玻片并转移到 ?新的含有1ml 1×PBS的24孔板的新孔。
2. 取出1×PBS，并更换1毫升的4％多聚甲醛溶液。
3. 在室温下孵育15分钟。
4. 除去4％多聚甲醛溶液，用1 ml洗涤三次的1x PBS。对于每次洗涤，在室温下孵育5分钟。
5. 取出最后一次洗涤并在1ml封闭缓冲液中室温封闭1小时。
6. 稀释小鼠抗Lamp1或小鼠抗EEA1到的最终稀释度在抗体孵育缓冲液中分别为1：100或1：1,000。
7. 除去封闭缓冲液，更换100微升适当的稀释抗体，并在4°C o/n孵育。
8. 取出稀释的抗体溶液，并用1ml 1×PBS洗涤3次。对于每次洗涤，在室温下孵育5分钟。
9. 稀释Alexa偶联的二抗。稀释山羊抗小鼠 Alexa-488和山羊抗兔Alexa-546至1:250的最终稀释度 ?抗体稀释缓冲液。
10. 取出洗涤液，加入200μl ?稀释的二抗溶液，并孵育1个帽室温度在黑暗中，以尽量减少光漂白。
11. 去掉第二抗体溶液，并用1ml洗涤3次的1x PBS。对于每次洗涤，在室温下孵育5分钟。
12. 加入200微升含有1微克/毫升DAPI的1×PBS，并在室温下孵育5分钟。
13. 除去含DAPI的溶液，并用1ml 1×PBS洗涤两次。对于每次洗涤，在室温下孵育5分钟。
14. 吸取10微升的FluorSave安装在显微镜载玻片上。使用镊子从个别井中删除盖玻片，轻轻删除 ?尽可能多的液体。将盖玻片轻轻放在幻灯片上和安装介质，确保没有气泡被捕获在盖玻片和滑块之间。移除额外的安装解决方案，并使载玻片在4℃下固化o/n。
15. 在适当的共聚焦或宽视场显微镜系统上的图像。
自定量化共定位
1. 将显微镜图像导出到16位tiff文件
2. 使用CellProfiler软件分析共定位（ http://www.cellprofiler.org ）。
3. 使用CellProfiler，生成一个管道，允许识别细胞边界和不同的对象：EEA1 囊泡，LAMP1囊泡和VAMP8囊泡。见Jean et al。（2015）for 详细方法
4. 通过跟随测量对象共定位在 http://www.cellprofiler.org/linked_files/ExampleColocalization_Tutorial.pdf 中找到的建议）。
5. 一旦建立了共定位对象的数量，就关联 ?使用excel的每单元colocalized对象的百分比。
摄取测定验证的重要实验性控制
为了确保有效和可解释的内吞摄取实验，应进行以下控制：
验证抗体在时间0时仅标记表面定位的蛋白质。
1. 包括仅在4℃下保持抗体结合的条件步骤，但不允许在37℃摄取。执行如其它具有摄取的时间点所述条件。染色应仅在等离子体周围定位膜，当通过共聚焦显微镜分析时，这将是明显的。
2. 鉴于大多数摄取实验依赖于瞬时转染并检测表位标签，混合细胞群将会存在于菜。因此，与转染效率一致，未转染的细胞不应显示任何染色。
3. 执行4 ?在不存在追踪抗体的情况下孵育（使用HA抗体标记VAMP8：3xHA）并固定细胞。使用常规染色细胞免疫荧光方案（具有原发性HA抗体和继发性抗体）抗体山羊抗兔Alexa-546）以鉴定稳态感兴趣的蛋白质的定位。对于许多蛋白质，总蛋白染色在稳态典型地检测信号主要开内部斑点，反映通过内部的蛋白质贩运隔间。
  总之，缺乏质膜染色在未转染的细胞中与专有的质膜染色在转染的细胞中在时间0，与点状图案偶联透化细胞，争论染色特异性。快速内吞的追踪蛋白（VAMP8：3xHA）进一步表明功能摄取测定。总之，这些结果验证内吞摄取测定。注意，该测定需要额外的修饰来监测将表面标记的货物再循环至质膜（van Weert等人， al。，2000）。
  
  图1.确保功能的控制实验吸收测定。A.用抗HA抗体标记的细胞，无37℃ ?孵化只显示表面膜染色，而（B）细胞追踪在37℃下30分钟显示细胞内染色。 C.总VAMP8：3xHA 通过常规免疫荧光检测显示大部分细胞内模式。

食谱

完成DMEM
从购买的500 ml HyClone瓶中取出55 ml DMEM
加入50ml胎牛血清（最终浓度为10％）加入5ml青霉素/链霉素溶液（得到最终浓度为1％）用过滤装置（0.2μm）过滤灭菌
1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）
将8g的NaCl，0.2g的KCl，1.44g的Na 2 HPO 4和0.24g的KH 2 PO 4
加入900ml dH 2 O
将pH调节至7.4
将最终体积调整为1,000 ml
在121℃高压灭菌20分钟，灭菌处理
4％多聚甲醛溶液
向80 ml 1x PBS中加入4 g多聚甲醛
加热至65°C（在水浴中），偶尔涡旋
用NaOH调节pH至7.4 用1x PBS完成至100 ml
过滤灭菌（0.2μm）
使用新鲜的
阻塞缓冲区
将5毫升山羊血清与95毫升1×PBS（产生终浓度5％）混合加入0.3ml Triton X-100（使用大口径吸头Triton X-100）（最终浓度为0.3％）
混合良好
抗体温育缓冲液
将0.1g BSA加入10ml 1×PBS（产生最终浓度为1％）中加入0.03ml Triton X-100（使用大口径吸头Triton X-100）（最终浓度为0.3％）
混合良好

致谢

摄取测定改变自先前公开的研究（Miller等人，2011），并且在（Jean等人，2015）中进行。免疫荧光方案改编自Cell Signaling Technology， http：//www.cellsignal .com/common/content/content.jsp？id = if 。这项工作是由FRSQ，AHA和CRS博士后研究支持SJ和NIH RO1 GM078176和从SDCSB NIH P50 GM085764到AAK的支持。

参考文献

Diril，M.K.，Wienisch，M.，Jung，N.，Klingauf，J.and Haucke，V。（2006）。 Stonin 2是一种用于突触结合蛋白内化和回收的AP-2依赖性内吞分选适配子。 Dev Cell 10（2）：233-244。
Jean，S.，Cox，S.，Nassari，S.and Kiger，A.A。（2015）。饥饿诱导的MTMR13和RAB21活性调节VAMP8以促进自噬体 - 溶酶体融合。 em> EMBO Rep 16（3）：297-311。
Jean，S.，Mikryukov，A.，Tremblay，M.G.，Baril，J.，Guillou，F.，Bellenfant，S.and Moss，T。 Extended-synaptotagmin-2在体内介导FGF受体内吞作用和ERK活化。 Dev Cell 19（3）：426-439。
Miller，S.E.，Sahlender，D.A.，Graham，S.C.，Honing，S.，Robinson，M.S.，Peden，A.A。和Owen，D.J。（2011）。网格蛋白适配子CALM对小R-SNARE的内吞作用的分子基础。 147（5）：1118-1131。
van Weert，A.W.，Geuze，H.J.，Groothuis，B。和Stoorvogel，W。（2000）。 Primaquine通过与内体的直接相互作用干扰从内体到质膜的膜再循环，其不涉及中和核内体pH或核内体的渗透性肿胀。 Eur J Cell Biol 79（6）：394-399。