材料和试剂

塑料12孔板（丹麦，Nunc）
注意：一个用于吸收步骤，一个用于每种处理（植物类型或培养条件）的解吸步骤。
塑料20ml用于放射性测量的小瓶（Ratiolab GmbH，Dreieich）
注意：如果要量化 P，每个植物需要一个小瓶 ?在根和叶子。小瓶应从1到N编号在开始实验之前。他们也应该按顺序放置适合于β计数器的适当机架（PerkinElmer）。
提示
年轻体外苗种
MES水合物（Sigma-Aldrich，目录号：M8250）
CaCl 2（Sigma-Aldrich）
（Sigma-Aldrich）
p-PO 4 5mCi/ml（40-158Ci/mg，1.48-5.84TBq/mg，> 99％同位素纯，小于0.5μMPi ）（PerkinElmer）
闪烁混合物（PerkinElmer，Ultima Gold ^TM）
MgSO 4 4 /
NH 4 3
KNO ₃
NaH 2 PO 4 sub
KI
FeCl <2>
MnSO 4
ZnSO 4
CuSO ₄
CoCl <2>
Na MoO 4
硫胺素
吡哆醇
烟酸
肌醇
蔗糖
Agar
MS/10介质（见配方）
库存解决方案（参见配方）
培养基（见配方）
解吸介质（参见配方）

设备

实验应当在工作台上或在通过白光照射的罩下（150-180μE^{m <-2> ^{^-1）进行。孵育步骤}}
液体闪烁计数器（PerkinElmer，Packard Instrument Company，型号：TRI-CARB）
用于解吸步骤的含冰大盒子（所有12孔板将在冰上水平放置2小时）
用于处理苗的镊子
如有必要，用剃须刀分离根部和空中部件
微信
防护辐射（有机玻璃）的盾牌
扫描器 ?或相机（Epson America，型号：Perfection V850Pro或Canon，型号： Powershot SX130），但其他设备从其他制造商可以完美适合

软件

ImageJ版本1.46r与NeuronJ插件（ http://imagej.nih.gov/ij ）

程序

植物材料的制备
9到11天的小植物便于实验
1. 当电镀时，将种子放在空间中以保持根系独立于每个单株;这将有助于测量时 ?根系长度（见下文）。每板播种6至10粒种子取决于生长培养基（分别具有高或低的Pi，参见下面）。每种植物类型需要2到3个平板（基因型或治疗取决于实验）。
2. 植物在改良的MS/10培养基中在12×12cm培养皿中垂直生长。
3. 对每个培养皿上的植物进行编号，以便单独识别每个根系
4. 每次处理需要10至12个重复，或者加入5至10个空白的植物。
5. 扫描或照片的板（在黑色和白色和jpg 格式）。使用方格纸作为测量根的比例尺长度。扫描应为300 dpi，照片应为约1,000 x 800 像素（这是ImageJ推荐的）。
6. 根长度测量和计算：我们使用ImageJ版本1.46r与NeuronJ插件（ http://imagej.nih.gov/ij ）。图1显示了一个板的照片，以及如何根长度用imageJ测量。刻度（1厘米使用图表纸）（图1A），然后用NeuronJ插件主要和跟踪侧根（粉红色痕迹，图1B）。值（以cm为单位）在Excel文件中传输。总根长度通过加法计算初级和侧根长度（参见图1中的详细方案图例）。
  
  图1.根长度测量。A.比例尺设置：与ImageJ，在方格纸（1,2）上跟踪1厘米的刻度，然后设置规模'（3）。这给出像素/cm（4）。 B.根长的测量： ?使用NeuronJ插件，加载图像文件（5），然后设置缩放（如定义 ?在一个）。通过沿着根（粉红色痕迹，7）绘制追踪（6）然后测量描迹（RUN，8）。根长度（cm）（9）的结果可以是复制到excel文件。 A和B是过程的截图。
孵化
1. 此步骤应在屏蔽后面进行，以防止辐射
2. 在开始一系列实验之前，您必须检查Pi 吸收在您的条件（植物特异性，温度， ?光）。为此，在30分钟和2小时之间进行时间进程遵循如下所述的方案。在我们的条件下，Pi 吸收总是线性的
3. 准备12孔板，每个植物处理一个。编号孔：1到12.
4. 每孔加入4ml培养基。每孔放置1株植物镊子（图2），根部应浸入和叶子外面 ?井。避免年轻苗期过度脱水孵化，仔细把盖子盖在盘子上避免将叶子浸入溶液中（图2B）。孵育2小时 ?在室温（22-24℃）下，在白光下（150-180μE m <-200s ^-1）。丢弃完全浸入液体中的植物，如果有的话
  
  图 ?2.孵育实验。A.具有植物的12孔板的照片在孵育培养基中编号1至12。盖板已经删除为了清楚。请注意，玫瑰花是在媒介和 ?根完全浸没。 B.照片的板和盖（侧面视图），显示了如何将盖子放置在12孔板上
5. 为了评估Pi在根上的吸附（机械或化学吸附可以发生在细胞上，但在这种情况下，Pi不会进入根细胞内），空白样品处理如下：将植物根浸泡在培养基中2秒（使用镊子）并直接在解吸培养基中转移2小时（见下文 ?解吸过程）。
解吸（见视频1）

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视频1.解析

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1. 准备新的12孔板，每孔3毫升冷的解吸培养基。将板放在冰上。
2. 在水中漂洗孵育的植物（1-2秒）
3. 在镊子的帮助下，转移植物（以相同的顺序你把他们在孵化溶液，1植物/井）与两片叶子并将根在冰上浸泡在解吸介质中2小时
4. 将每个植物转移到计数瓶中（使用镊子）。或者，用锋利的剃刀分开玫瑰花和根，把每个部分植物在一个单独的小瓶。把小瓶放在方便计数架，一旦你收获植物（为了避免错配）。
将植物在烘箱中在50℃下干燥过夜
放射性测量
1. 在化学罩下，加入2毫升闪烁鸡尾酒和紧顶部在每个计数瓶。然后将瓶子放在适合的架子上计数器
2. 使用β计数器，在每个样品（Cs）和中计数^{33
  
  在空白中（Cb是空白重复的平均值），也在孵育培养基（C <10），10μl温育培养基，计数小瓶和2ml闪烁混合物）。在里面闪烁鸡尾酒，β辐射在光子中转化由β计数器检测。度量单位为cpm（每分钟计数）。}
3. 数据分析：
  每小时每根厘米吸收的PO 4+的量（V，以nmol/h/cm计）如下计算：
  V =（Cs-Cb）*（S * 10 ）* B /（T×L sub×C 10） /> Cs：样品中的放射性（cpm）
  Cb：空白中放射性的平均值（cpm）
  S：培养基中的P 1浓度（S =50μMPi） S * 10 ^-3 = 0.05：孵育培养基中的Pi含量（nmol /μl）（S =50μM）。 C 10：在10μl孵育溶液中的放射性（cpm）。 C 10 /（S * 10 ^-2）是培养基中 P的比活性
  B = 10：在培育植物之前测量放射性的孵育溶液的体积（10μl是方便的）。
  T = 2：孵育2小时
  L _根：根长（cm）
  此外，使用与上面相同的方程，但省略L _root，你可以计算每株植物的Pi吸收（Cs对应于33P中的整个植物），每个玫瑰花结组织或根组织（Cs对应于33P 在叶子或根系统中）。
  这也是可能的 ?以计算在中测量的^{33p（叶中的Cs，以cpm计）的比率叶片相比于由全植株吸收的总的[33] ?根中的Cs（cpm）]。}

代表数据

Pi 对于在低或高Pi上生长的植物，每小时和每根cm的摄取（表格1）。呈现两种基因型（WT和突变体）以显示植物之间Pi吸收的变化范围和分布的植物中
表1.在低或高Pi吸收能力下生长的WT和突变体小植物中的Pi吸收和分布表示为每小时每根cm的nmol Pi（平均值±SD）。 Pi分布是由整个植物中的³³ P与³³ P的比率计算的。

食谱

MS/10中等
10倍稀释的Murashige和Skoog培养基，含有：
0.15mM MgSO 4 2.1mM NH 4 NO 3
1.9 mM KNO <3>
0.5（高Pi）或0.005（低Pi）mM NaH 2 PO 4
0.34mM CaCl 2·h/v 0.5μMKI
10μMFeCl 2
10μMH ₃ BO ₃
10μMMnSO 4
3μMZnSO 4
0.1μMCuSO 4
0.1μMCoCl 2
1μMNa 2 MoO 4·
5.9μM硫胺素 4.9μM吡哆素 8.1μM烟酸
55μM肌醇
3.4 mM MES
0.5％蔗糖和0.8％琼脂，pH5.5
库存解决方案
0.1mM CaCl 2在5mM MES中，在pH 5.5调节对于1L（水）：0.976g MES + 0.0147g CaCl 2，用10N NaOH调节pH至5.5 /
1 M KH 2 4
对于1L（水）：136g KH 2 PO 4 4 /
培养基（4ml /植物是必需的）
50μMKH 2 PO 4：储备溶液中：50μl1M KH 2 PO 4在1L储备液中解决方案
添加5,550Bq P/ml（0.15μCi P/ml）
解吸培养基（3ml /植物是必需的）
1mM KH 2 PO 4在储备溶液中：1ml 1M KH 2 PO 4在1L储备液中解决方案

致谢

该方案改编自先前公开的研究：Narang等人（2000）和Misson等人（2004），并且由Ayadi等人。（2015）。这项工作得到了委员会原子能和替代能源支持。

参考文献

Ayadi，A.，David，P.，Arrighi，J.F.，Chiarenza，S.，Thibaud，M.C.，Nussaume，L.and Marin，E。减少拟南芥 PHOSPHATE TRANSPORTER1转运蛋白的遗传冗余度，以研究磷酸盐吸收和 167（4）：1511-1526。
Misson，J.，Thibaud，M.C.，Bechtold，N.，Raghothama，K.and Nussaume，L。（2004）。拟南芥的转录调控和功能特性 Pht1; 4，高亲和力转运蛋白对磷酸盐剥夺植物中的磷酸盐摄取有很大的作用。植物分子生物学55（5）：727-741。
Narang，R.A.，Bruene，A。和Altmann，T。（2000）。分析不同的拟南芥种质中的磷酸盐捕获效率。植物生理学 124（4）：1786-1799。