材料和试剂

塑料12孔板（丹麦，Nunc）
注意：一个用于吸收步骤，一个用于每种处理（植物类型或培养条件）的解吸步骤。
塑料20ml用于放射性测量的小瓶（Ratiolab GmbH，Dreieich）
注意：如果你想在根和叶中量化33P，每个植物需要一个小瓶，或者每个植物需要两个小瓶。在开始实验前，小瓶应从1到N编号。它们也应该按照适合于β计数器的适当机架（PerkinElmer）放置。
提示
年轻体外苗子
MES水合物（Sigma-Aldrich，目录号：M8250）
CaCl 2（Sigma-Aldrich）
（185MBq/ml，1.48-5.84TBq/mg，> 99％同位素纯，小于0.5μMPi）（P <0.05），（P <0.05） PerkinElmer）
闪烁混合物（PerkinElmer，Ultima Gold ^TM）
MgSO 4 4 /
NH 4 3
KNO ₃
NaH 2 PO 4 sub
Kl
FeCl <2>
MnSO 4
ZnSO 4
CuSO ₄
CoCl <2>
Na MoO 4
硫胺素
吡哆醇
烟酸
肌醇
蔗糖
Agar
MS/10介质（见配方）
库存解决方案（参见配方）
1 M KH 2 PO 4（Sigma-Aldrich）（参见配方）
培养基（见配方）
解吸介质（参见配方）

设备

液体闪烁计数器（PerkinElmer，Packard Instrument Company，型号：TRI-CARB）
用于解吸步骤的含冰大盒子（所有12孔板将在冰上水平放置2小时）
用于处理苗的镊子
微信
防护辐射（有机玻璃）的盾牌
扫描仪或相机（爱普生美国，型号：Perfection V850Pro或佳能，型号：Powershot SX130），但其他制造商的其他设备可能适合

软件

ImageJ版本1.46r与NeuronJ插件（ http://imagej.nih.gov/ij ）
PRISM 6.0软件（GraphPad）

程序

植物材料的制备
生长在高和低Pi的9到11天的小植株便于实验
1. 当电镀时，将种子放在空间中以保持根系独立于每个单株;这将有助于测量时 ?根系长度（见下文）。每板播种6或10粒种子取决于生长培养基（分别具有高或低的Pi，参见下面）。每个植物类型需要9或8个平板（分别为高和低Pi）。
2. 植物在改良的MS/10培养基中在12×12cm培养皿中垂直生长。
3. 对每个培养皿上的植物进行编号，以便单独识别每个根系
4. 每次处理需要12株植物（培养基中的Pi浓度），加上空白的10株植物。
5. 扫描或照片的板（在黑色和白色和jpg 格式）。使用方格纸作为测量根的比例尺长度。扫描应为300 dpi，照片大约为1,000 x 800 像素（这是ImageJ推荐的）。
6. 根长度测量和计算：我们使用ImageJ版本1.46r与NeuronJ插件（ http://imagej.nih.gov/ij ）。图1显示了一个板的照片，以及如何根长度用imageJ测量。刻度（1厘米使用图表纸）（图1A），然后用NeuronJ插件主要和跟踪侧根（粉红色痕迹，图1B）。值（以cm为单位）在Excel文件中传输。总根长度通过加法计算主根和侧根长度（参见图1图例中的方案）
  
  图1.根长度测量 A.比例尺的设置：使用ImageJ，在方格纸上绘制1厘米刻度（1,2），然后"设置刻度"（3）。这个给出像素/cm（4）。 B.根长的测量：用NeuronJ 插件，加载图像文件（5），然后设置缩放（如A中定义）。加跟踪（6）通过沿根（粉红色痕迹，7）绘制然后测量 ?跟踪（RUN，8）。根长度（cm）（9）的结果可以复制到 ?excel文件。 A和B是过程的截图。
孵化
1. 此步骤应在屏蔽后面进行，以防止辐射
2. 在开始一系列实验之前，您必须检查Pi 吸收在您的条件（植物特异性，温度， ?光）。为此，在30分钟和2小时之间进行时间进程遵循Thibaud和Marin（2016）所述的方案。
3. 准备10个12孔板，每个点的Pi浓度：1， 5，10，20，50，100μM，对于在低Pi和200,500,1,000和200,000中生长的植物 ?对于在高Pi中生长的植物而言为2,000μM。井数：1到12（对于12 ?重复）每个Pi浓度
4. 加入4 ml温育培养基/孔。用镊子每孔放置1株植物（图2），根应该被浸没和叶子在井外。避免在孵化期间幼小植物的过度脱水，小心地在板上盖上盖子，避免叶子的浸泡在溶液中（图2B）。在室温下孵育2小时（22 ?-24℃）在白光下（150-180μE^{m <-200S ^-1）。丢弃植物 ?完全浸没在液体中，如果有的话
  
  图2.孵化实验。 A.植物编号为1至12英寸的12孔板的照片培养基。为了清楚起见，移除了盖板。请注意，玫瑰花是在媒介和根完全浸没。 B.照片的板和盖（侧视图）显示如何将盖子放置在12孔板上。}
5. 为了评价Pi对根的吸附（机械或化学吸附可以发生在细胞上，但在这种情况下，Pi不进入根内部细胞），空白样品如下处理：浸泡植物根在孵育培养基中2秒（使用镊子）和直接在解吸培养基中转移2小时（见下文解吸过程）。
解吸（见视频1）

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视频1.解析

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1. 准备新的12孔板，每孔3毫升冷的解吸培养基。将板放在冰上。
2. 在水中冲洗植物（1-2秒）。
3. 在镊子的帮助下，转移植物（以相同的顺序你把他们在孵化溶液，1植物/井）与两片叶子并将根在冰上浸没在解吸介质中2小时
4. 将每个植物转移到计数瓶（使用镊子）。它是方便在收获后立即将小瓶放在计数架上 ?植物（以避免错配）。
将植物在烘箱中在50℃下干燥过夜
放射性测量
1. 在化学罩下，每个添加2毫升闪烁鸡尾酒计数瓶和紧紧上面。然后将小瓶放在机架中适合计数器。
2. 使用β计数器，每个计数³³ P 样品（Cs）和空白（Cb是空白复制品的平均值）;和也在孵育培养基（C <10）中，10μl的温育培养基是置于计数小瓶中，加入2ml闪烁混合物）。在 ?闪烁鸡尾酒，β辐射在光子中转化由β计数器检测。度量单位为cpm（count per min）。
3. 数据分析：
  每小时每根厘米吸收的PO 4+的量（V，以nmol/h/cm计）如下计算：
  V =（Cs-Cb）*（S * 10 ）* B /（T×L sub×C 10） /> Cs：样品中的放射性（cpm）
  Cb：空白中放射性的平均值（cpm）
  S：培养基中的Pi浓度（S = 2至2,000μM）（S = 2?2,000μM）中的Pi含量（nmol /μl）。< S/10< C 10：在10μl孵育溶液中的放射性（cpm）。 C 10 /（S * 10 ^-2）是培养基中 P的比活性
  B = 10：在培育植物之前测量放射性的孵育溶液的体积（10μl是方便的）。
  T = 2：孵育2小时
  L _根：根长（cm）
4. 动力学参数通过绘制Eadie-Hofstee图计算其中V（Pi中每个Pi浓度的吸收的平均值介质）相对于V/S（平均值，S = 培养基）。这个表示揭示了两个摄取系统（高 ?或低亲和力，图3）。动力学参数（V sub max和K sub）通过每个摄取系统的线性回归计算：K m是斜率，V _max是V/S = 0（表1）的外推值。
  平均值和标准偏差（SD）可以从几个实验（这里未示出）计算。
5. 动力学参数也可以通过非线性回归计算（基于Michaelis-Menten动力学模型对V值 S）使用PRISM 6.0软件（GraphPad）分别用于高亲和力和低亲和力系统（表格1）。利用该过程，可以计算V max和K m的平均值和标准偏差（SD）。

代表数据

图3.Eadie-Hofstee图，其显示了每种Pi浓度吸收速率的平均值，线性回归和给出低（蓝色）和高（黑色）Pi转运活性的Km和Vmax值的方程式。/strong>

表1.使用Eadie-Hofstee图（来自图1）或使用Prism软件获得的V sub max和K sub的值

食谱

MS/10中等
10x稀释的Murashige和Skoog培养基，含有：
0.15mM MgSO 4
2.1mM NH 4 NO 3
1.9 mM KNO <3>
0.5（高Pi）或0.005（低Pi）mM NaH 2 PO 4
0.34mM CaCl 2
0.5μMKI
10μMFeCl 2
10μMH sub 3 BO 3
10μMMnSO 4
3μMZnSO 4
0.1μMCuSO 4
0.1μMCoCl 2
1μMNa 2 MoO 4·
5.9μM硫胺素 4.9μM吡哆素 8.1μM烟酸
55μM肌醇
3.4 mM MES
0.5％蔗糖和0.8％琼脂，pH5.5
库存解决方案
0.1mM CaCl 2在5mM MES中，在pH 5.5调节对于1L：0.976g MES + 0.0147g CaCl 2，用10N NaOH调节pH至5.5 /
1 M KH 2 4
对于1L：136g在水中

培养基（4ml /植物是必需的）
5,550 Bq P/ml（0.15μCi<33 P P/ml）然后，在40ml储备溶液中，在40ml储备溶液中，用适当体积（参见下表）制备1μM或100mM KH 2 PO 4 4至2μM至2,000μM终浓度的等分试样， sup> 33 P，如下所示：

最终Pi浓度（μM）	2	5	10	20	50	100	200	500	1,000	2,000
1 M KH sub 2 PO 4 sub（μl）							10	20	40	80
100mM KH 2 PO 4（μl）	0.8	2	4	8	20	40

解吸培养基（3ml /植物是必需的）
1mM KH 2 PO 4在储备溶液中：1ml 1M KH 2 PO 4在1L储备液中解决方案

致谢

该方案改变自先前公开的研究，Narang等人（2000）由Misson等人修改。（2004）和Aung等人（2006）基于Hosftee（1952）的研究。我们承认所有这些作者以前的工作。本议定书由Ayadi等人（2015）出版。这项工作得到了委员会原子能和替代能源支持。

参考文献

Aung，K.，Lin，S.I.，Wu，C.C.，Huang，Y.T.，Su，C.L.and Chiou，T.J。（2006）。 pho2，一种磷酸盐过度积聚物，是由microRNA399靶基因中的无义突变引起的。 Plant Physiol 141（3）：1000-1011。
Ayadi，A.，David，P.，Arrighi，J.F.，Chiarenza，S.，Thibaud，M.C.，Nussaume，L.and Marin，E。减少拟南芥 PHOSPHATE TRANSPORTER1转运蛋白的遗传冗余度，以研究磷酸盐吸收和信号。植物生理学167（4）：1511-1526。
Hofstee，B.H。（1952）。关于酶反应中常数Vm和KM的评估科学 116（3013）：329-331。
Misson，J.，Thibaud，M.C.，Bechtold，N.，Raghothama，K.and Nussaume，L。（2004）。拟南芥的转录调控和功能特性 Pht1; 4，高亲和力转运蛋白对磷酸盐剥夺植物中的磷酸盐摄取有很大的作用。植物分子生物学55（5）：727-741。
Narang，R.A.，Bruene，A。和Altmann，T。（2000）。分析不同的拟南芥种质中的磷酸盐捕获效率。植物生理学 124（4）：1786-1799
Thibaud，M.和Marin，E.（2016）。 ³³ P-PO <4>吸收能力和根的测量到拟南芥中的叶至叶转移。生物协议 6（5）：e1741。