材料和试剂

玻璃底35mm培养皿（MatTek，目录号：P35G-1.5-20-C）
培养中的HeLa贴壁细胞
编码荧光蛋白XRCC1-GFP的质粒
注意：将XRCC1序列（NCBI P18887）克隆在Clontech pEGFP-N1载体中限制性位点EcoRI/ApaI处。
转染剂（LipoFectamine 2000）（Life Technologies，目录号：11668027）
注意：目前，它是"Thermo Fisher Scientific，Invitrogen?，目录号：11668027"。
含有10％胎牛血清（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：16000-044）的DMEM [DMEM（1x）+ GlutaMAX TM（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：31966-021）

设备

细胞培养箱（Thermo Fisher Scientific，型号：NAPCO 5400）
注意：目前，它是"BioSurplus，目录号：NAPCO 5400"。
尼康A1倒置共聚焦显微镜配备环境室，允许控制温度，湿度和气体混合物注意：使用的激光器如下：用于微照射的405nm激光器和用于可视化GFP荧光的488nm氩激光器。使用目标63x。

软件

NIS软件
注意：它用于使用时间测量功能定量微照射区域的荧光强度。

程序

将HeLa细胞接种在35mm玻璃底培养皿（250,000个细胞）中 ?每皿），并用XRCC1-GFP质粒转染24小时后脂质体2000根据制造商的建议。
转染后24小时，用405nm进行显微照射二极管激光器设置为5％功率。激光功率在光纤出口处是4mW，并且在10x目标的出口处大约1mW瓦特。
通过将激光器固定在100％的激光下进行测量点漂白与数字手持光功率PM100D从 THORLABS。
1. 使用512×512的图像大小以60倍物镜以4的放大率进行刺激和获取。
2. 定义5μm的刺激线并进行微辐射 6秒。在微照射之前拍摄六幅图像以进行计算基础荧光水平。在微照射后，形成图像每2秒进行1分钟。
3. 在每个实验中微生物照射10至20个细胞。
注意：为了确定在每个不同的显微镜中使用的激光器的强度，可能有用的是监测参与单链断裂修复（SSBR）的蛋白质的募集，例如XRCC1和参与双链断裂修复的蛋白质（DSBR ），如53BP1或NBS1，并保持诱导XRCC1而非DSBR蛋白募集的条件。在我们的情况下，只有在加入DNA插入剂Hoechst 33342之后，我们可以观察到DSBR蛋白的募集，所以我们可以验证在我们的条件下，我们主要诱导SSB。

分析和定量

测量微照射区域的荧光强度为每个时间点。在微照射之前拍摄六个图像以便量化将被视为的荧光的平均值该区域的蛋白质的基础水平，并用于标准化测量（此值设置为1）。
为了量化XRCC1的富集因子微照射区域观察到的每个时间点的强度除以在微照射之前测量的平均强度。
在图中显示至少10个细胞的平均值。误差棒表示SEM。
重要的是检查在采集过程中是否有漂白，如果需要，是否正确。为了做到这一点，我们在表示相同量的XRCC1-GFP的另一个细胞中定义了在相同扫描区域中的标准目标区域（ROI-2）。在刺激和采集期间，在微辐射的细胞和非微辐射的细胞中监测荧光强度。如果存在漂白，我们将观察到非微辐照细胞中荧光的减少。在我们的系统中不是这样，因此不需要进一步修正。如果观察到漂白，建议调整采集条件以减少该问题。

代表数据

图1.用405nm激光对表达XRCC1-GFP或突变蛋白XRCC1（L360D）的HeLa细胞进行显微照射。 A）呈现的图像对应于微辐射之前的细胞和微辐射之后的1分钟。微辐射区域由虚线表示。突变蛋白XRCC1（L360D），其不再具有被招募到SSB的能力被用作对照。 B）在微照射区域对应于XRCC1-GFP的荧光强度被定量并显示在图中。误差条表示10个独立细胞的SEM。

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视频1.表达XRCC1-GFP蛋白的HeLa细胞用405nm激光

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致谢

我们感谢IRCM显微镜设施。这项工作由INSERM和来自癌症协会（PJA 20131200165）和CEA放射生物学计划的资助。

参考文献

Campalans，A.，Kortulewski，T.，Amouroux，R.，Menoni，H.，Vermeulen，W.and Radicella，J.P。 XRCC1募集对单链断裂和碱基切除修复的不同时空模式和PARP依赖性。 a> Nucleic Acids Res 41（5）：3115-3129。