材料和试剂

带有通风帽的25mm培养瓶（Corning，目录号：430639）
96孔板平底（Corning，Costar ，目录号：3599）
弯曲杆菌培养物
UltraPure TM Tris缓冲液（粉末形式）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：15504-020）
来自鸡蛋白的溶菌酶（Sigma-Aldrich，目录号：L-6876）
L-谷氨酸γ-（3-羧基-4-硝基苯胺）铵盐（Sigma-Aldrich，目录号：49525）
甘氨酰甘氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：G3915）
Pierce TM BCA蛋白测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：23227）
4-硝基苯胺（Sigma-Aldrich，目录号：185310）
炉底输液介质（Thomas Scientific，Oxoid，目录号：CM1032B）
Tris/HCl（pH 7.6和pH 8.2）
裂解缓冲液（见配方）
反应缓冲液（参见配方）
pNA储备溶液（见配方）

设备

吸光度酶标仪（例如BMG Labtech GmbH，Fluorstar Omega等）
Vibra-Cell TM Sonicater（Sonics& Materials，型号：VC40）
冷冻台式离心机
anoxomat系统（MART Microbiology）

程序

在5ml心浸液（HI）肉汤中稀释弯曲杆菌预培养物至0.05的光密度600nm。在具有通气帽的垂直放置的25mm培养烧瓶中，在微量厌氧气氛（MART）中，在42℃，160rpm，HI肉汤中培养培养物直至静止期约20小时。
注意：如果其他细菌种类的测定使用物种的特定生长条件。
细胞培养物的细胞，去除上清液并将沉淀物在-80℃下储存至少1小时。
注意：-80°C冷冻步骤有助于破坏细胞，更短的温育将导致更少的细胞破坏。
将沉淀重悬于冰冷的250μl裂解缓冲液中，并在冰上孵育30分钟
在40mV下超声6次（每次5秒，在冰上15秒间隔），输出控制设定为80％。
在4℃下，以12,000×g离心细胞裂解液10分钟。
收获上清液，使用前保存在冰上。
根据试剂盒的方案，在96孔板中测量20μl上清液（标准的BCA试剂盒）的蛋白质浓度。
在50mM Tris/HCl（pH 7.6）中，在标准pNA [4-硝基苯胺（储备溶液1mM）]的0至200μM范围内进行系列稀释。
将20μl上清液或标准pNA在96孔板中与180μl反应缓冲液混合
在37℃下孵育30分钟期间，每60秒在405nm波长（OD 405）下测量96孔板中的样品和标准品的光密度（图3和图4 ）。
计算所获得图的线性范围内所有值的斜率（见下文）。
GGT活性表示为nmol min <-1> mg蛋白^-1。

图3.典型的pNA标准曲线

图4.以时间显示由空肠弯曲杆菌（红色）和外显子R 突变体（蓝色）制成的细菌裂解物中pNA增加的图。

为了计算GGT活性，首先绘制pNA标准曲线。计算线性范围内的Δ吸光度（A时间x - A时间y）。接下来将每个样品的计算的Δ吸光度与标准pNA曲线进行比较，以确定在时间x和时间y之间产生的pNA的量（nmol pNA）。

GGT活性由下式计算：（nmol pNA）
T x M
T =孵育时间（以分钟计）
M =通过BCA蛋白试剂盒确定的mg蛋白质
GGT活性报告为nmole/min -1 /mg蛋白^-1

示例：
Δ吸光度（wt）= 0.58（15min）-0.43（5min）= 0.15
Δ吸光度0.15 = 40nmole pNA
时间x - 时间y = 10分钟
M = 0.02mg蛋白质
GGT活性为：40 /（10×0.02）= 200nmole/min /mg蛋白

食谱

裂解缓冲液
50mM Tris/HCl（pH7.6）
1μg/ml溶菌酶
反应缓冲液
2.9mM L-γ-谷氨酰基-3-羧基-4-硝基苯胺
100mM甘氨酰甘氨酸 100mM Tris/HCl（pH8.2）
pNA储液
1mM 4-硝基苯胺 50mM Tris/HCl（pH7.6）
可以储存在-20°C

致谢

本文和van der Stel等人（2015）中描述的γ-谷氨酰转肽酶活性方案从Chevalier等人（1999）中描述的方案修改。这项工作由NWO-ECHO拨款711.012.007支持MW。

参考文献

Chevalier，C.，Thiberge，J.M.，Ferrero，R.L。和Labigne，A。（1999）。幽门螺杆菌的基本作用γ-谷氨酰转肽酶用于胃的定植粘膜的小鼠。 Mol Microbiol 31（5）：1359-1372。
Hanigan，M.H。（1998）。 γ-谷氨酰转肽酶，谷胱甘肽：其在癌发生中的表达和功能。 Chem Biol Interact 111-112：333-342。
Heisterkamp，N.，Groffen，J.，Warburton，D。和Sneddon，T.P。（2008）。人类γ-谷氨酰转移酶基因家族。 Hum Genet 123（4）：321-332。
Ong，P.L.，Yao，Y.F.，Weng，Y.M.，Hsu，W.H.and Lin，L.L。（2008）。残基Arg114和Arg337对于大肠杆菌 gamma的正常功能至关重要-glutamyltranspeptidase。 Biochem Biophys Res Commun 366（2）：294-300。
van der Stel，A.X.，van Mourik，A.，Laniewski，P.，van Putten，J.P.，Jagusztyn-Krynicka，E.K.and Wosten，M.M。空肠弯曲杆菌RacRS双组分系统通过直接上调γ-谷氨酰转肽酶（GGT）激活谷氨酸合成，。 Front Microbiol 6：567.