材料和试剂

明胶胶囊（HF胶囊）（Matsuya Co.）
水稻植物（见注）
多聚甲醛（Electron Microscopy Sciences，目录号：12300）
二甲胂酸钠缓冲液（TAAB Laboratories BATCH，目录号：90760）
戊二醛（Electron Microscopy Sciences，目录号：16220）
鞣酸（Sigma-Aldrich，目录号：403040）
磷酸盐缓冲液粉末（Siyaku，Wako Pure Chemical Industries，目录号：167-14491）
乙醇（Siyaku，Wako Pure Chemical Industries，目录号：057-00456）
LR White树脂（Electron Microscopy Sciences，London Resin Company，目录号：14381-CA）
针对（1; 3,1; 4）-β-D-葡聚糖（小鼠IgG，Kappa Light）（Biosupplies，目录号：400-3）的单克隆抗体
注意：在Biosupplies的网站上它被命名为（1-3; 1-4）-β-D-葡聚糖。
山羊抗小鼠IgG pAb，Gold 15nm，EM（BBI Solutions，目录号：EM.GMHL15）
磷酸盐缓冲盐（Takara Bio Company，目录号：T900）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A2058）
乙酸乙酯（Siyaku，Wako Pure Chemical Industries，目录号：554-85072）
铅染色溶液（Sigma-Aldrich，目录号：18-0875-2-25ml-J）注意：此试剂可能不在日本以外提供，可以用替代铅污染物替代。作为替代，读者参考用于植物细胞的电子显微镜的更一般的实验手册（Hall和Hawes，1991）。
分子筛（Sigma-Aldrich，目录号：M6141）
固定解决方案（参见配方）
2％戊二醛溶液（见配方）
100％乙醇溶液（见配方）
1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）（参见配方）

设备

生长室（Nippon Medical& Chemical Instruments，型号：LH220S）
Ultracut UCT超薄切片机（Leica Microsystems）
隔膜真空泵（Leybold-Heraus，型号：Divac 2.2 L）
干燥器（Sanplatec，型号：PC-250K）
网格（Okenshoji，目录号：09-1079）
透射电子显微镜（JEOL USA，型号：JEM-1400plus）
CCD照相机（Olympus软成像解决方案有限公司，型号：Veleta）

程序

将水稻叶片切成长度≤2mm的块，并立即将其浸入固定溶液中。固定溶液应在通风橱下处理。

图1.嵌入和修剪。 a。设备和试剂。 b。用新鲜的100％LR白色树脂填充明胶胶囊底部的组织。 C。聚合。 d。修剪。
将组织/固定剂置于干燥器中，其连接至隔膜真空泵。在非常缓慢地释放真空之前，使用真空泵在室温下将组织/固定剂真空脱气1分钟。
在4℃下孵育组织/固定剂2小时
用50mM二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.4）轻轻冲洗组织三次，每次15分钟。
使用梯度乙醇系列（70％，80％，90％，并且在100％下三次）在4℃下将组织脱水30分钟。偶尔旋转。
用100％（v/v）乙醇和100％（v/v）LR White树脂的50:50混合物将组织浸泡三次，每次30分钟。
转移组织到100％LR白色树脂和浸泡组织三次，每次1小时，在室温下。该步骤确保不会残留残留的乙醇，因为其它化学品如乙醇或者防止LR树脂的聚合
将组织沉降到填充有新鲜的100％LR白色树脂的明胶胶囊的底部（图1b）。将试管架中的明胶胶囊置于50℃聚合过夜（图1c）。
将组织块倒置，并将其固定在UCT超薄切片机。使用剃刀刀片（图1d）夹紧并修剪该块以暴露组织表面积达1.0平方毫米。

图2.剖切。用超薄切片机切片。 b。将超薄部分安装在网格上。
用金刚石刀在UCT超薄切片机上将块切成80nm（图2a）。使用镍网格网将浮动在金刚石刀船中的水上的串联部分浸没，并将超薄部分安装在网格上（图2b）。
用一滴小鼠抗（1; 3,1; 4）-β-D-葡聚糖抗体（在1％BSA溶液中稀释1：1,000，取决于靶一级抗体的丰度）孵育网格，室温90分钟（图3a）。
用1％BSA/1×PBS冲洗网格三次，每次1分钟
将网格浮在与1-BSA/1×PBS中的15-nm金颗粒1:20偶联的山羊抗小鼠IgG的小滴上，在室温下1小时。当检测其他一抗时，制备与金颗粒偶联的山羊抗小鼠IgG以匹配一抗

图3.免疫染色（a）和用乙酸铀酰染色（b）
用1x PBS冲洗网格和切片三次。
将网格和切片浸入2％戊二醛溶液中，并在通风橱中风干
将切片浸入用蒸馏水稀释的2％乙酸双氧铀液滴中15分钟（图3b）。
用蒸馏水冲洗切片。
浸渍切片与铅染色溶液在室温下3分钟。用蒸馏水冲洗切片。
使用JEOL JEM 1200EX透射电子显微镜在80kV的加速电压下观察切片。
用CCD照相机获得数字图像（2048×2048像素）。

代表数据

图4.在叶片中显示了MLG的基于免疫金的定位。。（a）中的图像是具有疣状突起（WP）的表皮细胞的细胞壁。比例尺=5μm。 b。（a）中矩形的放大率更高。比例尺=1μm。 C。（c）中的图像是皮层厚壁的细胞壁的图像。比例尺=5μm。 d。（c）中矩形的放大率更高。比例尺=1μm。

笔记

在28℃，在15/9h光/暗循环（150μmol-2μm）下，在生长室中生长水稻（水稻，日本晴> s ^-1）。该方案使用水稻植物的第五叶叶进行。

食谱

固定解决方案
通过将0.4g多聚甲醛，0.05g丹宁酸和0.1ml 10％戊二醛溶解在9.9ml 50mM二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.4）中制备固定溶液。将该溶液在加热板/搅拌器上的通风橱中加热至约30℃。 70°C，直到溶液澄清
2％戊二醛溶液
根据制造商的方案，将适当体积的Wako Pure Chemical Industries现成的粉末溶解在蒸馏水中，在室温下制备pH 7.4的0.1M磷酸盐缓冲液。通过稀释磷酸盐缓冲液中的10％戊二醛制备2％戊二醛溶液。
100％乙醇溶液
为了制备100％乙醇溶液，在瓶子底部使用100％含有分子筛的大量乙醇
1x PBS
将10个PBS片溶于蒸馏水中，使总体积为1000ml

致谢

电子显微镜分析由Tokai Electron Microscopy（Nagoya，Japan）进行。本研究由日本科学促进会（JSPS）和教育，文化，体育科学技术部（MEXT），日本[创新地区科学研究资助"植物细胞壁作为信息处理系统"（No.24114001,24114005）和KY的科学研究授权（C）（25440124）。

参考文献

Hall，J.L。和Hawes，C.R。（1991）。植物细胞的电子显微镜。学术出版社。
Kido，N.，Yokoyama，R.，Yamamoto，T.，Furukawa，J.，Iwai，H.，Satoh，S.and Nishitani，K。基质多糖（1; 3,1; 4）-β-D-葡聚糖参与硅依赖性强化稻细胞壁。植物细胞生理学56（2）：268-276。
Yokoyama，R。和Nishitani，K。（2004）。植物细胞壁多样性的基因组基础。水稻和拟南芥中基因家族的比较方法植物细胞生理学 45（9）：1111-1121。