A。实验设计

材料和试剂

标签棒（Hermann Meyer KG，目录号：180230）
塑料棒（Hermann Meyer KG，目录号：180206）
橡胶粘合剂（Hermann Meyer KG，目录号：321234）
大麦种子
70％白泥炭
30％粘土
N（氮气功率）
P ₂ O ₅
K ₂ O
混合粘土土ED73（H.Nitsch& Sohn GmbH& Co.KG）（参见Recipes）

设备

温室设施
可移动的温室长椅（80 x 100厘米）
方形锅（16×16×16cm）（Hermann Meyer KG，目录号：720016）
用于浇水的烧杯（VWR International，目录号：213-3402）
标签（Baumann Industries，目录号：2.508.003）
称重秤（KERN& SOHN GmbH）
隔室干燥器（Heratherm oven）（Thermo Fisher Scientific）

程序

通过加热，通风和照明在温度范围为20至22°C（16 h）和17至19°C（夜间）（8 h）的长日照条件下调节温室。如果自然辐射低于20 klx，应从上午6点至下午10点提供额外的光，并应使用高于30 klx的阴影（灯泡高度附加照明的光强度约为10 klx）。
均匀化不同袋子的ED 73土壤的含量，以优化花盆之间的可比性
对应于具有限定重量的土壤（在我们的情况下，在土壤的干物质为40％时为1,500m 2/g）的相应的湿度填充方形罐。
标记盆和每盆大麦基因型的10个种子（在我们的情况下，对于156个基因型的对照和干旱胁迫处理三个重复）。为了更好的可见性，标签可以固定在标签桩上（图1）。
根据选择的实验设计（在我们的情况下是分裂图设计），在每个温室工作台上放置20个由基因型数量排序的盆。控制和压力治疗分配给单独的长椅（图1）。
将所有罐子的水量提高到最大土壤水容量（WC）的70％。根据DIN ISO 11465 1996-12（Paech和Simonis，1952），在三个示例性罐中，根据饱和土壤重量和干重计算加入的水的重量如下：
1. 将纱布放在底部，用土填满三盆，加水至饱和。
2. 等待6小时，直到水通过重力排出并称重
3. 在105℃下干燥土壤（在室干燥器中两天）并称重。
4. 100％WC由饱和度的重量减去干重计算
5. 盆浇水的重量对应于70％（对照）或20％（干旱胁迫）WC加干重和盆重。
每天给水70％的WC称重
发芽后，每盆减少幼苗至七株
为了最小化植物位置的影响，可移动工作台应每天移动
干旱胁迫在播种后7天（das）开始于初生叶期[BBCH 10，根据Stauss（1994）]。此时幼苗大麦植物的初生叶完全膨胀。停止应力变量的浇水，直到锅重量达到20％WC。通过在实验时间内称重十个示例性的应力锅来检查这一点
然后保持这个水平通过称重每个锅，并重新水每天的重量为20％的WC。
水控制植物每天至70％WC（植物的重量被忽略）。

图1.温室盆栽实验（播种后10天）
在36天（BBCH 33），达到四周的胁迫期，并测定生理参数，以及根据以下方案B至G收获生物量。为了分析生理性状，应使用初生叶，因为在这些最古老的叶上，干旱胁迫诱导的叶衰老首先发生（图2）。

图2.初级叶片在叶片衰老过程中干旱胁迫响应差异

笔记

在我们的盆栽实验中证明，有必要在单独的盆栽实验中测量叶子衰老的参数，因为只有这样才有可能分离干旱胁迫诱导的叶衰老和年龄相关叶衰老的影响缺乏诱导叶衰老。为了实现这一点，除了主叶（图3A）外，通过将所有大麦叶（在桩上具有橡胶粘合剂）捆扎约14天，使其它叶在主叶上的遮蔽效应最小化。一般设置与上述相同，但是只有四株植物在较小的盆（12×12×12cm，550g土壤）中生长，对照和胁迫处理的盆在温室长椅上成行混合（图3B） br />

图3.在对照（左）和干旱胁迫处理（右）播种后36天的单株植物。 B.在播种后20天的一个温室台，四行应激处理（黄色条）和三行对照处理（黑色条）。

食谱

混合粘土土ED73
70％白泥炭
30％粘土，pH?6和1kg/m 3 矿物营养素
1. 14％N
2. 16％P <2> 5
3. 18％K 2 O
2 kg /m3长期肥料
1. 20％N
2. 10％P 2 O 5
3. 15％K <2>

B。叶衰老：叶色

材料和试剂

如上所述生长的大麦植物

设备

叶绿素仪SPAD-502 Plus（柯尼卡美能达）

程序

在播种后33-34天，在初级叶上直接在温室中测量叶色（das）。
使用Minolta SPAD读数，测量表示叶衰老状态的叶色是非破坏性的。
用空夹子校准后，取5个均匀分布的读数 ?在每盆三个主叶（三个大麦植物）的每个上 ?由SPAD-Meter进行平均。
在每个主叶，测量应在上侧进行叶子和叶子的中间避免夹住中间叶脉（图4）。

图4.测量三个主叶上的叶色的位置

C。叶片衰老和耐旱性：PSII的电子传递速率

材料和试剂

如上所述生长的大麦植物

设备

OS1p叶绿素荧光计（Opti-Sciences）

程序

确定光系统II（PSII）的电子传递速率（ETR）作为34-35天的叶子衰老的参数。使用便携式OS1p（图5），在轻适应植物上测量叶绿素荧光是非破坏性的。因为该分析非常光敏，所以应当在锅位于温室台上的位置进行精确测量，并且应该使用温室的阴影以确保在所有测量期间的连续照明条件。此外，测量应在上午10点之前进行，而不是在下午3点（中午）之后，接受每日光合作用的最佳值。

图5.OS1p-叶绿素荧光计。显示屏向右显示三个示例测量值，左上角显示一般设置。除此之外，用于测量的叶夹被示出包括具有触发按钮和用于检测光合有效辐射（PAR）的传感器的夹子。

对于用荧光计测量，首先选择光合产量菜单Y（II）。
调整50％的调制强度，100％的饱和强度和ETR计算包括公式ETR = Y（II）* PAR * 0,84 * 0.5。除了测量的光合有效辐射（PAR）和PSII的量子光合产率（Y（II））外，叶片吸收的光的常数（0.84）和由PSI和PSII ）]（Krall和Edwards，1992）。
对在叶的上侧的三个主叶中间的每个花盆进行三次测量。将叶子放在夹子中，叶子边缘在夹子底部。然后等待，直到光脉冲完成由窥视指示。
数据转储存储在荧光计的存储器中，并且以后可以通过USB传输读出，并对每个罐进行平均。

笔记

荧光计还提供Y（II）的值，但在这里使用ETR（μmol/m 2），因为包括PAR以补偿潜在的照明变化。

D。耐旱性：可溶性糖的总含量

材料和试剂

移液管（1,000μl/10ml）（Eppendorf/Finnpipette Labsystems）
管（15ml）（VWR International，目录号：525-0308）
管（2ml）（VWR International，目录号：211-2120）
试管（玻璃）（VWR International，目录号：4.902.002.75）
如上所述生长的大麦植物
液氮
D-葡萄糖（VWR International，目录号：1.08337.0250）
聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）（VWR International，目录号：1.07302.0100）
蒸馏水
硫酸100％（VWR International，目录号：1.00713.1000）
硼硅酸盐玻璃瓶（棕色）（VWR International，目录号：215-2328）
Anthrone（VWR International，目录号：1.01468.0010）
硫脲（VWR International，目录号：1.07979.0250）
硫酸70％（见配方）
蒽酮试剂（见配方）

设备

称重秤（KERN& SOHN GmbH）
剪刀
Styropor框
冷冻干燥机（Christ Alpha 1-4 LD plus）
水浴（GFL）
振动器（Vortex Genie 2）（科学工业）
试管架（Geyer GmbH& Co，目录号：9.905 970）
玻璃弹珠（玩具店，直径15毫米）
离心机（23,000×g）（Tuttlingen Germany，型号：Hettich Universal 16R）
注意：目前，它是"Gemini BV Laboratory，型号：Hettich Universal 16R"。
Cuvette（VWR International，目录号：634-9014）
分光光度计（Thermo Fisher Scientific，型号：Genesys 10S UV VIS）
烧杯（VWR国际，目录号：213-1131）

程序

首先，准备一个葡萄糖含量的标准曲线，应该为每个蒽酮试剂重复。

在五个试管中制备五种不同稀释度的D-葡萄糖（每种500μl）：0μM，50μM，100μM，150μM和200μM。
通过涡旋将每个试管缓慢加入2.5ml蒽酮试剂直到存在澄清溶液
继续执行步骤12-14以及样品。
测量后绘制葡萄糖含量的标准曲线（图6）

图6.葡萄糖含量的标准曲线

在36 das样品用于分析可溶性糖的总含量并根据Yemm和Willis（1954）进行分析。
从每盆五个原叶中间切下1厘米的块（100-200毫克）
称重这些（鲜重仅用于计算干重重量克分子渗透浓度的含量），填充管（15ml）作为每盆的合并样品 ?并使用styropor盒在液氮中冷冻
然后将样品冷冻干燥并重新称重（干重）
加入4毫升蒸馏水（取决于叶组织的量取样），并将样品在水浴中在100℃下煮沸30分钟（使用试管架水浴）。
冷却后，将1,000μl样品溶液加入填充有0.05g PVPP的管（2ml）中并涡旋
在23,000×g（5000rpm）下离心管子5分钟
将200μl上清液转移到试管中，加入300μl蒸馏水
通过缓慢涡旋加入2.5ml蒽酮试剂，直到存在澄清溶液
在每个玻璃管上放一块玻璃大理石（图7）并煮沸溶液在100℃水浴中15分钟（使用试管水浴架）。
在冷水浴（20℃）中冷却10分钟
通过a直接测量样品（图7）（最大1小时时间） ?分光光度计在625nm使用比色杯。零点校准应该 ?用蒸馏水

图7.试管准备就绪测量可溶性糖的总含量。示例性地，三次测试管具有对照样品（浅蓝色，左）和三个试管用于干旱胁迫（深蓝色，右）处理的样品
使用标准曲线计算可溶性糖的总含量，并相对于干重（μmol/g）设定。

笔记

在步骤D11中取出的200μl样品体积对于大麦和不同作物的不同发育阶段而变化，并且取决于取样的叶组织的量。重要的是，步骤D11中的最终体积为500μl。体积应定义为标准曲线的最佳范围。

食谱

70％硫酸（在棕色瓶中混合并在黑暗中孵育12小时） 70ml硫酸（100％） 30 ml蒸馏水
蒽酮试剂（稳定一天）
硫酸（70％）
920 mg/l蒽酮
920mg/l硫脲

E。耐旱性：游离脯氨酸含量

材料和试剂

铝箔
管（15ml）VWR International，目录号：525-0308）
塞子（VWR国际，目录号：217-0511）
移液管（1,000μl/10ml）（Eppendorf/Finnpipette Labsystems）
如上所述生长的大麦植物
液氮
L-Proline（VWR International，目录号：1.07434.0010）
Toluol（VWR International，目录号：1.08325.1000）
蒸馏水
茚三酮（VWR International，目录号：1.06762.0100）
冰醋酸（AppliChem，目录号：A0820.2500）
水合试剂（见配方）

设备

称重秤（KERN& SOHN GmbH）
剪刀
Styropor框
冷冻干燥机（Christ Alpha 1-4 LD plus）
水浴（GFL）
试管（玻璃）（VWR International，目录号：4.902.002.75）
试管架（Geyer GmbH& Co，目录号：9.905 970）
玻璃弹珠（玩具店，直径15毫米）
振动器（科学工业，型号：Vortex Genie 2）
磁力搅拌器（RCT basic）（IKA Labortechnik）
Fortuna Optifix安全分配器（Sigma-Aldrich，目录号：Z260207）
通风橱
Cuvette（VWR International，目录号：634-9014）
分光光度计（Thermo Fisher Scientific，型号：Genesys 10S UV VIS）
烧杯（VWR国际，目录号：213-1131）

程序

首先，制备脯氨酸含量的标准曲线，应该对每种茚三酮试剂重复。

在五个试管中制备五种不同稀释度的L-脯氨酸（各500μl）：0μM，25μM，50μM，75μM和100μM。
通过涡旋慢慢地向每个试管中加入2ml茚三酮试剂，直至存在澄清溶液
继续执行步骤D11-16以及样品。
测量后绘制脯氨酸含量的标准曲线（图8）。

图8.脯氨酸含量的标准曲线

在36天时，取用于分析游离脯氨酸含量的样品 ?并根据Bates等人（1973）进行分析。对于这个分析可以使用相同的样品溶液作为可溶性的总含量因为步骤5-8是一样的。
从每个盆中五个初级叶的中部切割1cm片（100-200mg）。
称重这些（鲜重仅用于计算干重重量克分子渗透浓度的含量），填充管（15ml）作为每盆的合并样品 ?并使用styropor盒在液氮中冷冻
然后将样品冷冻干燥并重新称重（干重）
加入4毫升蒸馏水（取决于叶组织的量取样），并将样品在100℃水浴中煮沸30分钟（使用试管架水浴）。
冷却后，将1000μl样品溶液各自填充在试管中
通过缓慢涡旋加入2ml茚三酮试剂，直至存在澄清溶液
在每个试管上放置玻璃大理石（见图7）并煮沸溶液在100℃水浴中15分钟（使用试管架水浴）。
在冷水浴（20℃）中冷却10分钟使用实验室通风柜进行下一步骤：
取出玻璃大理石，加入5毫升甲苯（例如用分配器）。
用塞子关闭试管，涡旋15秒
在室温下在黑暗中孵育样品（可能长达4小时）。
发生两个阶段（图9），从上面的阶段开始转移到用于在520处用分光光度计测量的比色皿中 ?nm。零点校准应使用甲苯进行。

图9.测试管准备测量游离脯氨酸的含量。示例性地，三个试管，具有对照样品（浅红色，左）和三个带有用于干旱胁迫（深红，右）处理的样品的试管显示。
使用标准曲线计算游离脯氨酸的含量，并相对于干重（μmol/g）设定。

笔记

在步骤E9中，使用1000μl的样品溶液。该体积对于大麦的不同发育阶段以及对于不同作物是不同的，并且取决于取样的叶组织的量。体积应定义为标准曲线的最佳范围。

食谱

水合试剂（稳定一天，在黑暗中混合，用铝箔覆盖烧杯并在磁力搅拌器上溶解）
0.5克茚三酮
20ml蒸馏水
30ml冰醋酸

F。耐旱：渗透压

材料和试剂

管（2ml）（VWR International，目录号：211-2120）
移液管（100μl/200μl）（Eppendorf）
如上所述生长的大麦植物
液氮
蒸馏水
osmomat的校准标准（Gonotec GmbH，目录号：30.9.0020）

设备

称重秤（KERN& SOHN GmbH）
剪刀
Styropor框
镊子
摇摆磨（Retsch，型号：MM200）
研磨球（VWR International，目录号：412-0070）
研磨罐（Retsch，目录号：22.008.0005）
振动器（科学工业，型号：Vortex Genie 2）
离心机（21,000×g ）（Wehingen，型号：Hermle Z233MK2）
注意：目前，它是"HERMLE Labortechnik GmbH，型号：Hermle Z233MK2"。
Osmomat（Gonotec GmbH，型号：Osmomat 3000 Gonotec）
用于osmomat的管（Gonotec GmbH，目录号：30.9.0010）

程序

在36天，重量克分子渗透压浓度通过蒸馏水和细胞液的凝固点的比较测量来确定。

从每盆五个原叶的中间切下1厘米的块。
称量这些，将每盆中的合并样品填充在管（2ml）中，并使用styropor箱在液氮中冷冻。
也将研磨球和研磨罐放入液氮（进入styropor盒）
取每个试管，用镊子填入两个研磨球
取出研磨罐，每个填充五个管。
在摇摆磨中研磨叶子3分钟（30 /秒）
向管中加入200μl蒸馏水并涡旋
用镊子将研磨球从管中取出。
以21,000×g（15,000rpm）离心管4分钟15分钟。
吸取上清液细胞液在新管（2毫升）使用osmomat进行测量时，请使用osmomat的原始管。
使用15μl校准标准品校准osmomat，直到达到准确的0.3的值。
用15μl蒸馏水调整零值。
每个测量15微升细胞液。
可以对水含量校正值（osmol/kg）（鲜重和干重的差异）。干重计算为与用于测定的样品的干重含量的关系的游离脯氨酸含量和可溶性糖的总含量以上）。

G。耐旱性：生物量产量

材料和试剂

如上所述生长的大麦植物

设备

称重秤（KERN& SOHN GmbH）
Crispack包（Baumann，目录号：3.331.100）
剪刀
隔室干燥器（Heratherm oven）（Thermo Fisher Scientific）

程序

在36天，每盆切割整个生物量高于地面。
将每个锅的生物量与标签放在一个包装袋中
关闭行李。
在105℃的室干燥器中干燥袋内的生物质，直到重量不变（通风约两天）。
通过称重干重，检测总生物量产量（g）

致谢

作者感谢Halle-Wittenberg马丁路德大学作物植物研究跨学科中心（IZN）为该项目提供资金。此外，一些协议是从先前承认Bates等人（1973），Paech和Simonis（1952）以及Yemm和Willis（1954）的工作修改或调整的。

参考文献

Bates，L.S.，Waldren，R.P.and Teare，I.D。（1973）。快速测定水分胁迫研究中的游离脯氨酸。植物土壤 39：205-207。
Krall，J.P。和Edwards，G.E。（1992）。光系统II活性与CO ₂固定之间的关系 Pysiol Plantarum 86：180-187。
Paech，K。和Simonis，W。（1952）。 Pflanzenphysiologische Praktika Band Iübungenzur Stoffwechselphysiologie der Pflanzen。 Springer Verlag，BerlinG?ttingenHeidelberg。
Stauss，R。（1994）。单子叶植物和双子叶植物的生长阶段识别密钥摘要：扩展BBCH标度 Ciba。
Wehner，G.G.，Balko，C.C.，Enders，M.M.，Humbeck，K.K.and Ordon，F.F.（2015）。涉及对干旱胁迫和干旱胁迫的耐受性的基因组区域的鉴定诱导幼苗大麦叶片衰老。/a> BMC Plant Biol 15：125
Yemm，E.W。和Willis，A.J。（1954）。蒽醌在植物提取物中碳水化合物的估计。生物化学杂志em> 57（3）：508-514。