材料和试剂

0.2μm无菌注射器过滤器（Corning，目录号：431219）
显微镜载玻片和盖玻片
针（30号）
3mm Whatman滤纸（GE Healthcare，Dharmacon，目录号：1006090）
注意：目前，它是"Sigma-Aldrich，目录号：1006090"。
矿物油（Sigma-Aldrich，目录号：M5904）
多聚甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：F8775）
25％戊二醛（Junsei，目录号：273721250）
sodium carcodylate（Ted Pella，目录号：18851）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P5379）
乙醇（Merck Millipore Corporation，Calbiochem ，目录号：1.00983.1011）
氢氧化钠（NaOH）（Sigma-Aldrich，目录号：30620）
四氧化锇（OsO 4）（Ted Pella，目录号：96049）
Spurr树脂（Ted Pella，目录号：183004221）
双端模具（Ted Pella，目录号：10590）
甲苯胺蓝O（Sigma-Aldrich，目录号：T3260）
EDTA（BioShop，目录号：EDT001.500）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8532）注意：此产品已停产。
4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（Sigma-Aldrich，目录号：32670）
乙酸（Merck Millipore Corporation，Calbiochem ，目录号：1.00063.1011）
1/2强度的Karnovsky的固定溶液（见配方）
甲苯胺蓝O溶液（见配方）
固定解决方案（参见配方）
DAPI解决方案用于开发花粉（参见配方）
用于成熟花粉粒的DAPI溶液（参见配方）

设备

超微切片机（Boeckeler Instruments，型号：MT990机动精密切片机）
热板
水浴
孵化器
通风橱
光和荧光显微镜（Leica Microsystems，型号：DM2500）
真空泵和真空瓶
玻璃吸管

程序

用于光学显微镜的拟南芥花蕾的半薄切片

嵌入拟南芥花蕾

在2ml管中收集整个花序
加入1ml 1/2强度的Karnovsky's固定溶液（Karnovsky， 1965）放入管中并用3MM Whatman滤纸覆盖溶液的表面。
将管在真空瓶中在400mmHg下孵育30分钟
将管在4℃孵育4小时至过夜
用1ml的0.1M碳酸氢钠溶液洗涤样品三次（pH7.4），在摇动器上每5分钟轻轻搅拌
使用玻璃吸管在4℃下用1ml的1％四氧化锇进行后固定处理过夜。
注意：如果你想做免疫染色，不要执行后固定与四氧化锇。这可以抑制抗体的结合抗原。
将样品用10,20,30,40,50,60,70， 80和90％乙醇，每次处理连续30分钟 100％乙醇过夜。
制备中等大小的树脂根据制造商的协议在罩，然后孵育spurr树脂 ?在真空罐中30分钟以消除气泡

浸润将在步骤A1-h制备的球形树脂加入到步骤中的脱水样品 A1-g，并通过以下方法除去样品的残留乙醇程序

步骤	100％乙醇：纯树脂	时间（h）
①	3 ：1	4
②	1 ：1	4
③	1 ：3	4
④	- ：4	过夜

用spurr树脂填充双端模具托盘的底部，然后在58℃下孵育过夜以制作下拉面板。
将样品浸入模具托盘中，用spurr树脂，然后在58℃下孵育3天。
从模具托盘取出块，并将样品保持在室温。

嵌入在spurr树脂中的样品的半薄切片
1. 用刀片修剪树脂块的端部，使梯形以试样为中心（图1）。
  
  图1.树脂块嵌入的标本。 A.嵌入固化树脂中的拟南芥花序。 B.用剃刀修剪的树脂刀片。
2. 将树脂块固定在切片机的头部。
3. 切割1-10微米横向切片的树脂嵌入标本使用MT-990电动精密切片机与玻璃刀。四 ?在Borg等人的（2009）的情况下制造了5μm的横截面
4. 收集浮动样品在水中与载玻片上铂丝并将载玻片与样品放在热板上 ?50℃5分钟
5. 滴下100微升的甲苯胺蓝溶液表面的部分用注射器，然后在上面干燥热板在50℃下5分钟
6. 洗涤样品洒水，使用注射器，然后干燥幻灯片上的多余的水分在50℃下放在热板上
7. 滴20μl的矿物油和用盖玻片覆盖，然后用指甲密封盖玻片的边缘清漆（图2）。
  
  图2.用盖玻片在载玻片上用甲苯胺蓝溶液染色的切片

用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对发育中的小孢子和成熟花粉的荧光显微镜分析
1. 用DAPI染色制备成熟花粉粒
  1. 用固定溶液（Oh em et al。，2010）打开鲜花将整个花序固定5分钟。
    注意：如果您想检测荧光蛋白或GUS染色，请跳过此步骤。
  2. 在包含200μlDAPI的1.5ml管中从拟南芥（Sanders等人，1999）在花阶段13-14收集3-4个开放的花溶液（Park等人，1998）。
  3. 以最大速度短暂涡旋管10秒，以从开裂的花药壁分离花粉粒
  4. 在黑暗中在室温下孵育试管30分钟
  5. 转移上清液到一个新的1.5毫升管与200微升移液器人注意：不要离心。除上清中的花粉外，不得转移任何其他花器官。
  6. 通过在13,000rpm离心30分钟浓缩花粉粒秒，然后弃去上清液
  7. 将花粉颗粒悬浮于5-10μlDAPI溶液中
  8. 将这个样品放在显微镜载玻片上的盖玻片下。
2. 用DAPI染色从花药制备发育中的小孢子
  1. 用开放的花在固定溶液中固定整个花序（Oh等人，2010），持续5分钟。
    注意：如果您要检测荧光蛋白或GUS染色，请跳过此步骤。
  2. 在显微镜载玻片上从花序解剖单花药用针同时加入4-5μl0.3M甘露醇或DAPI溶液（Park等人，1998）。
  3. 在载玻片上收集1.5ml管中的游离小孢子，并在黑暗中孵育30分钟
  4. 将这个样品放在显微镜载玻片上的盖玻片下。
3. 使用固定在Leica DM2500显微镜上的相机获取图像在epifluorescence通道（15％的405nm/430-470nm的DAPI，对于GFP是470nm/530nm，对于DsRed是561nm/570-610nm）（图3）（Kim等人 2015）。
  
  图3.拟南芥花药的横切面图像根据光学显微镜用甲苯胺蓝溶液染色协议

食谱

1/2强度的Karnovsky固定剂溶液
2％多聚甲醛
2.5％戊二醛
0.1M二甲胂酸钠（pH7.4）使用前请立即准备此溶液
甲苯蓝溶液
将粉末溶解在1或2ml水中以制备最终的0.05％溶液，并将该溶液通过0.2μm无菌注射器过滤器过滤。将此溶液在4℃避光保存。
固定解决方案
乙醇：乙酸= 3:1 在使用前请立即准备此溶液。
DAPI解决方案开发花粉
0.1M磷酸钠（pH7.0） 1mM EDTA（pH8.0） 0.1％Triton X-100 1μg/ml DAPI
将此溶液储存在4°C避光保存
成熟花粉粒DAPI解决方案 0.1M磷酸钠（pH7.0） 1mM EDTA，pH8.0 0.1％Triton X-100 0.4μg/ml DAPI
将此溶液储存在4°C避光保存

致谢

这项研究得到了由教育部资助的韩国国家研究基金会（no。2013R1A1A2062335）的下一代生物绿色21计划（PJ01104701），大韩民国农村发展管理局和基础科学研究计划的资助。此协议基于Kim al。（2015）。

参考文献

Berger，F。和Twell，D。（2011）。植物中的种系规范和功能 Annu Rev Plant Biol 62：461-484。
Borg，M.，Brownfield，L。和Twell，D。（2009）。男性配子体发育：分子视角 J Exp Bot 60（5）：1465-1478。
Karnovsky，M.J。（1965）。高摩尔渗透压浓度的甲醛 - 戊二醛固定剂，用于电子显微镜。 J Cell Biol 27（2）：137A-138A
Kim，M.J.，Kim，M.，Lee，M.R.，Park，S.K.and Kim，J.（2015）。 LATERAL ORGAN BOUNDARIES DOMAIN（LBD）10 与 SIDECAR进行互动POLLEN/LBD27 以控制拟南芥中的花粉发育。 81植物J 81（5）：794-809。
McCormick，S。（2004）。控制雄性配子体发育。植物细胞 16 Suppl ：S142-153。
Oh，S.A.，Park，K.S.，Twell，D。和Park，S.K。（2010）。 SIDECAR POLLEN 基因编码小孢子特异性LOB/AS2结构域蛋白对于不对称细胞分裂的正确时序和方向是必需的。 64（5）：839-850。
Park，S.K.，Howden，R。和Twell，D。（1998）。拟南芥配子体突变双子叶花粉 1 可破坏小孢子极性，分裂不对称和花粉细胞命运。 125（19）：3789-3799。
Sanders，P.M.，Bui，A.Q.，Weterings，K.，McIntire，K.N.，Hsu，Y.C.，Lee，P.Y.，Truong，M.T.，Beals，T.P.and Goldberg，R.B。（1999）。拟南芥中的另一个发育缺陷雄性不育突变体 < em> Sex Plant Repro 11（6）：297-322。