材料和试剂

Standard Cryomold（Electron Microscopy Sciences，Tissue-Tek，目录号：4557）
女性MRL/MpJ [3个月（健康）和12个月（患病）]和MRL/MpJ-Fas lpr/J [9周（疾病前）和3个月/>
过氧化物酶块（Dako，目录号：K4009）
山羊抗小鼠Rae-1γ（R& D Systems，目录号：AF1136）
山羊Histofine简单染色试剂盒（NICHIREI CORPORATION，目录号：414161F）
AEC +底物 - 色原（Dako，目录号：K3464）
PBS（Sigma-Aldrich，目录号：P5493）
水性封固剂（Vecor Labs，目录号：H-5501）
丙酮（Sigma-Aldrich，目录号：320110）
组织冷冻培养基（Leica Biosystems Nussloch GmbH，目录号：14020108926）
苏木精（Sigma-Aldrich，目录号：H9627）

设备

Leica Leitz DM RB显微镜（Leica Microsystems），带有适配的奥林巴斯相机（Olympus Imaging America，型号：DP70）
Macintosh或Windows PC

软件

Photoshop CS6（Adobe）
Matlab v。2013a（MathWorks）

程序

样品准备
1. 通过腹侧中线切口将肾脏移除到腹部的牺牲小鼠。肠横向缩回以暴露 ?动物的肾脏。肾脏从周围组织释放 ?并切除。
2. 将肾脏在1x PBS中短暂洗涤，放置在低温模具内，覆盖有OCT组织冷冻介质和卡扣通过将低温模具放置在液氮顶部来冷冻
3. 然后使用低温恒温器将冷冻切片肾切成10μm切片。
  1. 关于如何切割切片的一般指导，请参考Fischer等人（2008）所做的工作。
4. 将待处理的样品在室温下解冻10分钟，然后用冰冷的100％丙酮在-20度固定10分钟。
注意：
1. 将同种型孵育的载玻片用作阴性对照。
2. 所有洗涤步骤在Coplin罐中进行。
1. 切片在1×PBS中洗涤2×5分钟。
2. 内源性过氧化物酶使用DAKO的赘水过氧化物酶封闭 ?根据制造商的说明在室温下封闭7分钟
3. 切片在1×PBS中洗涤2×5分钟。
4. 切片与山羊抗小鼠Rae-1γ抗体（1/100 在含有10％FBS和2.5％BSA的1×PBS中稀释）在4℃过夜
5. 切片在1×PBS中洗涤2×5分钟。
6. 根据制造商的说明书，将切片与山羊Histofine简单染色试剂盒在RT温育30分钟
7. 切片在1×PBS中洗涤2×5分钟。
8. 根据制造商的说明书，将切片在室温下用AEC +底物 - 色原体染色15-20分钟
9. 通过用蒸馏轻轻冲洗载玻片来终止反应来自洗瓶的水（不要将流体直接聚在纸巾上）
10. 切片用苏木精复染3分钟。
11. 通过将载玻片置于流动自来水下10分钟停止反应
12. 将1滴水性封固剂置于每个载玻片上，小心地加入盖玻片以不形成气泡
13. 将载玻片在室温下干燥1小时
14. 通过定量测量色原沉积通过使用已建立的方法进行免疫组织化学（参见B节 "图像分析"）。
15. 肾小球的图像（放大100倍）在Leica显微镜（垂直Leitz DM RB）中获得奥林巴斯（DP70）相机;图像文件保存在带标签的图像文件中格式（抗体染色的图像称为EXP和对照图像被称为CON??TROL）。
图像分析
然后在Photoshop中打开所有图像，并如下处理[根据Matkowsky等人，（2000）]：
1. 在Photoshop中打开图片。
2. 定义选框工具的大小参数。
  1. 双击选框图标。
  2. 以像素（200 x 200像素区域）定义面积。
  注意：该区域必须任意选择尽可能最小区域，其中可以看见整个肾小球。然后用户必须 ?继续选择那些适合舒适的肾小球 ?区域（参见步骤B7）。相同的像素区域必须用于所有样本每组。在我们的例子中，200×200像素区域被证明是最适合。
3. 使用选框工具标识要分析的区域。
4. 存储在新文件中。
  1. 功能"编辑"选择"复制"。
  2. 功能"编辑"选择"新建文件"。
  3. 在新文件中选择"粘贴"。
  4. 功能"保存"为文件类型选择tiff。
5. 将新文件存储在Matlab文件夹中。
6. 打开Matlab。
  在光标（?）类型
  ?a = double（imread（'EXP'，'tiff'））;
  ?b = double（imread（'CONTROL'，'tiff'））;
  ?ea = norm（a（：，：，1））+ norm（a（：，：，2））+ norm ?eb = norm（b（：，：，1））+ norm（b（：，：2））+ norm ?et = abs（ea-eb）;
  ?en = sqrt（et o2/N）
7. 根据该方案，测定色原体/像素的量 ?通过在200×200像素区域中选择肾小球（25个肾小球/组） ?并减去数学能量（在步骤B6计算的EM）对照载玻片（对照 - 未暴露于一抗）的同源肾小球在实验载玻片上（EXP-暴露于 Rae-1抗体）。
  注意：使用了200 x 200像素区域，因为它被证明是能够包括的区域大小所有样品的肾小球以最可能的同源方式。这个大小必须根据手边的样品进行调整。

代表数据

图1.来自1岁的MRL/MpJ小鼠模型的肾中IHC Rae-1染色（红色）的实施例。在10x。A阴性对照。 B.与Rae-1抗体孵育的载玻片

图2.在100x放大率下从肾小球提取的实施例200×200像素区域。 A.来自阴性对照玻片的肾小球; B.来自Rae-1孵育玻片的肾小球。
来自MRL小鼠的健康，疾病前和疾病模型的肾小球中Rae-1的定量的代表性结果。使用这种技术，我们能够确定MRL小鼠的疾病模型中的Rae-1表达水平高于健康的和疾病前的（Spada等人，2015）。

图3.MRL小鼠肾小球中Rae-1γ染色的定量使用双尾，不配对的学生t检验（平均6SD; n = 5 /组; ** P， 0.0001; * P，0.0025）。

笔记

这种技术允许量化绝对量 Rae-1抗体色原体的每个像素在肾小球的健康和患病小鼠。然而，这种技术不限于肾小球或Rae-1抗体，因为它可以根据需要进行修饰 ?任何细胞中任何抗体的染色强度的测定 ?区域或结构。
所有样品（包括阴性对照）都是至关重要的处理和同时分析，以便最小化变化染色结果。

致谢

这项工作部分得到了西班牙经济和竞争力部（SAF-2008-00471和SAF-2011-23639; DFB），马德里地区政府（CCG08-CSIC/SAL-3451; DFB ）和西班牙卫生，社会服务和平等部，Carlos III健康研究所合作研究专题网络计划：炎症和风湿病研究网络（RIER; RD08/0075/0015; DFB）和西班牙国家生物银行网络/0076/00101到FJD）。 R. S.得到了来自西班牙经济和竞争力部的FPI授职奖学金的支持。我们要感谢Matkowskyj等人（2000）的工作，该工作是该协议的基础。

参考文献

Fischer，A.H.，Jacobson，K.A.，Rose，J。和Zeller，R。（2008）。冷冻切片组织 CSH Protoc 2008：pdb prot4991。
Matkowskyj，K.A.，Schonfeld，D。和Benya，R.V。（2000）。通过使用市售软件photoshop和matlab测量累积信号强度的定量免疫组织化学。 J Histochem Cytochem 48（2）：303-312。
Spada，R.，Rojas，J.M.，Perez-Yague，S.，Mulens，V.，Cannata-Ortiz，P.，Bragado，R.and Barber，D.F。 NKG2D配体在狼疮性肾炎中的过度表达与肾脏中NK细胞活性和分化增加有关，但与.Leukoc Biol 97（3）：583-598。