材料和试剂

设备

程序

注意：为了处理细菌培养，必须使用无菌技术，每个步骤都应在无菌层流罩中进行。
第1天

将来自甘油储备液的细菌细胞在补充有呋喃妥因（100μg/ml）的LB琼脂板上划线，所述硝化呋喃糖素是天牛抗性的抗疟原虫。应通过溶解在二甲基甲酰胺（DMF）中制备500x呋喃妥因（500ml/ml）的储备溶液
孵育LB板在37°C（细菌生长的最佳温度）过夜（约18小时）。

第2天

使用金属接种针或无菌牙签在CPG琼脂平板上从单个菌落中划线过夜生长的细菌细胞。孵育接种的CPG琼脂板在30°C（生产色素的最佳温度，这是对紫外线细菌耐受性的主要决定因素）48小时（图1）。

图1.在CPG琼脂平板上生长的伯克霍尔德氏菌菌株。左上和底部平板：的颜料产生菌株。 glumae 。右上图：B的色素缺陷菌株。 glumae 。在30℃孵育48小时后拍照。

第4天

通过用手轻拂，将在CPG琼脂上生长的细菌菌落在无菌微量离心管中的无菌水中重悬。
使用分光光度计将细菌浓度调节至OD 600 = 0.1（?0.5×10 7 sup/CFU/ml）。
在无菌dH 2 O中以1:10的比例稀释细菌悬浮液。
传播100微升的稀释的B。在CPG板上的glumae 细胞
公开 B。在来自G15T8杀菌荧光灯的紫外光下，在层流罩中，在70cm的距离，253.7nm的波长下，在不同的持续时间（图2），将帚毛细胞接种到UV光。在UV暴露期间应关闭盖子。

图2.显示紫外线照射程序的图像
为了准确地确定CFU的数量，应当制备高达1:1000的系列稀释液并将其在CPG琼脂板上铺开
将接种的平板在30℃下孵育48小时

第6天

计数存活的细菌菌落（图3）

图3.在UV暴露后存活的细菌菌落的图像。上两行： glumae 。从左到右：每个垂直行代表分别暴露于UV 0，10,20,40和60秒的CPG琼脂板。
将数据转换为暴露于紫外线辐射的不同时间内的存活百分比。
存活率（％）=来自UV暴露细胞的＃菌落/来自非UV暴露细胞的＃菌落×100

食谱

致谢

这项工作得到美国农业部NIFA（Hatch项目＃：LAB93918和LAB94203），路易斯安那州立大学农业中心和路易斯安那州理事会（研究与开发项目：LEQSF（2008-11）-RD-A-02 ）。该协议从我们之前在PLoS ONE中公开的工作（Karki等人，2012）修改。

参考文献

Karki，H.S.，Shrestha，B.K.，Han，J.W.，Groth，D.E.，Barphagha，I.K.，Rush，M.C.，Melanson，R.A.，Kim，B.S.and Ham，J.H。 Burkholderia glumae菌株的毒力，抗真菌活性，色素沉着和DNA指纹的多样性。 PLoS One 7（9）：e45376。