材料和试剂

重组蛋白过表达和蛋白质纯化
1. 1ml比色杯10×10×45mm（Sarstedt AG，目录号：67.742）
2. 色谱柱GSTrap（GE Healthcare，目录号：17-5130-01），HisTrap（GE Healthcare，目录号：17-5255-01），Superdex 200 HR 10/300GL（GE Healthcare，目录号：17-5175-01），HiPrep 16/60 Sephacryl S-300HR（GE Healthcare，目录号：17-1167-01）]
3. Amicon Ultra离心过滤器（Merck Millipore Corporation）截留分子量（MWCO）取决于蛋白质大小[例如30kDa（Merck Millipore Corporation，MWCO，目录号：UFC903024）]
4. MicronSep滤纸，0.22,47mm（Carl Roth GmbH + Co.，目录号：A009.1）
5. 大肠杆菌（大肠杆菌）菌株用过表达转化的过表达（例如，Rosetta DE3）质粒包括感兴趣的具有N-或C-末端的蛋白质序列谷胱甘肽-S-转移酶（GST-）或组氨酸（His-）标签
6. 用作1％溶液的来自酪蛋白（Carl Roth GmbH + Co.，目录号：8952.2）的胰蛋白胨/蛋白胨
7. 用作0.5％溶液的酵母提取物（Oxoid，目录号：LP0021）
8. 用作1％溶液的氯化钠（NaCl）（Carl Roth GmbH + Co.，目录号：9265.2）
9. 根据E的抗生素。大肠杆菌菌株
10. 异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）（Carl Roth GmbH + Co.，目录号：2316.4）用作1M溶液，过滤灭菌
11. 99.5％变性乙醇和1％MEK（VWR International，目录号： 85033.460），用作在ddH 2 O中稀释的20％溶液，过滤器脱气
12. 咪唑
13. 谷胱甘肽
14. 溶菌酶培养基（LB）培养基（参见配方）
15. 裂解缓冲液（见配方）
16. 亲和缓冲区（请参阅配方）
17. HisTrap的洗脱缓冲液（参见配方）
18. GSTrap的洗脱缓冲区（参见配方）
19. 尺寸排阻缓冲液（SEC）（参见配方）
制备蛋白粗提物
1. 纸毛巾
2. Aspergillus nidulans 菌株的孢子
3. Miracloth（Merck Millipore Corporation，目录号：475855-1R）
4. 用作0.95％溶液的氯化钠（NaCl）（Carl Roth GmbH + Co.，目录号：9265.2）
5. 液氮（空气液体）
6. 最小培养基（见配方）
7. 50x AspA（请参阅食谱）
8. 微量元素（参见配方）
9. B *缓冲区（参见配方）
丁二烯基化测定
1. 凝胶吸印纸（Schleicher& Schuell BioScience GmbH，目录号：10426694）
2. 印迹膜Amersham TM Protran TM sup0.45μmNC（GE Healthcare，目录号：10600002）
3. 甲醇（VWR International，目录号：20864.320）
4. 2-丙醇HiPerSolv CHROMANORM（VWR International，目录号：20880.320）
5. 页尺寸预染蛋白梯（Thermo Fisher Scientific，目录号：26616）
6. 丙烯酰胺Rotiphorese Gel 30（37,5：1）（Carl Roth GmbH + Co.，目录号：3029.1）
7. Sucofin脱脂奶粉（TSI GmbH，目录号：ST00227）
8. α-CulA，α-Nedd8抗体（GenScript）
9. 单克隆α-微管蛋白抗体（Sigma-Aldrich，目录号：T0926）
10. α-肌动蛋白抗体（Novus Biologicals，目录号：NB100-74340）
11. α-山羊兔二抗（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，目录号：G21234）
12. α-山羊小鼠二抗（Jackson ImmunoResearch，目录号：115-035-003）
13. 对 - 香豆酸（Sigma-Aldrich，目录号：C9008-5G）将400mM储备溶液溶解于DMSO中（避光保存 -20°C）
14. 鲁米诺（Carl Roth GmbH + Co.，目录号：4203.1）用作溶于DMSO的250mM储备溶液（避光，存储在-20°C）
15. 2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，Fluka Chemika，目录号：63700）
16. 用作7％，0.1％，1％，0.2％溶液的十二烷基硫酸钠（SDS）（Carl Roth GmbH + Co.，目录号：CN30.3）
17. 用作0.3％溶液的溴酚蓝（Sigma-Aldrich，Riedel-deHa?n，目录号：32768）
18. 使用10％溶液的过硫酸铵（APS）（Sigma-Aldrich，Fluka Analytical，目录号：09913-100G）
19. 四甲基乙二胺（TEMED）（Carl Roth GmbH + Co.，目录号：2367.1）
20. Tween-20（Carl Roth GmbH + Co.，目录号：9127.1）
21. 用作250mM溶液的Tris-PUFFERAN （Carl Roth GmbH + Co.，目录号：4855.3）
22. 用作2.5M溶液的大豆（Carl Roth GmbH + Co.，目录号：3187.3）
23. 30％过氧化氢（H 2 O 2）（Merck Millipore Corporation，目录号：822287.2500）
24. 3x SDS样品缓冲液（见配方）
25. 12％SDS凝胶（见配方）
26. 2x分辨缓冲液（参见配方）
27. 2x堆叠缓冲区（参见配方）
28. 10x SDS运行缓冲液（参见配方）
29. 10x传输缓冲区（参见配方）
30. 10x TBST（Tris-缓冲盐水Tween 20）缓冲液（参见配方）
31. 阻止解决方案（参见配方）
32. 检测溶液A（参见配方）
33. 检测溶液B（参见配方）
其他（用于多种方法的材料和试剂）
1. 微管1.5ml（Sarstedt AG，目录号：72.690.001）
2. 微管2.0ml（Sarstedt AG，目录号：72.691）
3. 管115×28mm，PP（Sarstedt AG，目录号：62.559.001）
4. 5ml试管
5. 2升烧瓶
6. PPCO离心瓶（Slaughte，Nalgene，目录号：525-2316）
7. Oak-Ridge离心管，50ml（Carl Roth GmbH + Co.，目录号：PK03.1）
8. 300ml带挡板的烧瓶中
9. 渠道
10. 碎冰
11. 用作1M溶液的1,4-二硫苏糖醇（DTT）（Carl Roth GmbH + Co.，目录号：6908.2）
12. 反式琥珀酰-L-亮氨酰氨基（4-胍基）丁烷，E-64蛋白酶 ?抑制剂（Sigma-Aldrich，目录号：E3132）解决方案
13. 用作100mM异丙醇溶液的苯甲基磺酰氟（PMSF）（Carl Roth GmbH + Co.，目录号：6367.3）
14. 双蒸馏水（ddH 2 O）
15. 微孔水
16. 用作2M溶液的氯化钠（NaCl）（Carl Roth GmbH + Co.，目录号：9265.2）
17. 三盐酸盐（Tris-HCl）（Carl Roth GmbH + Co.，目录 number：9090.3）
  注意：准备一系列具有不同浓度和pH的Tris-HCl溶液，包括pH 6.8,7.5,8.0和pH 8.8的1M溶液;具有pH 8.8的0.75M溶液;具有pH 8.0的100mM溶液。
18. 用作0.5mM溶液的乙二胺四乙酸（EDTA）（Carl Roth GmbH + Co.）
19. Nonoxinol-40（NP-40）（Affymetrix，USB Corporation，目录号：19628）
20. 甘油（Carl Roth GmbH + Co.，目录号：3783.1）
21. 完全蛋白酶抑制剂混合物（Roche Diagnostics，目录号：11873580001）（参见Recipes）

设备

Biowave DNA Llife Science分光光度计（Biochrom WPA，目录号：80-3004-70）
离心Sorvall RC3B Plus（Thermo Fisher Scientific）
离心Sorvall RC5B Plus（Thermo Fisher Scientific）
Rotor Sorvall SS34（Thermo Fisher Scientific）
?KTAexplorer10（GE Healthcare，目录号：18-1300-00）
pH计pH526（Sigma-Aldrich，型号：WTW）
过滤器和脱气系统（Satorius）
真空泵（KNF NEUBERGER，目录号：2.03360238）
超声波Sonoplus HD2070（Bandelin）
Superloop 1/16"（GE Healthcare，目录号：18-1113-82）
样品环5ml（GE Healthcare，目录号：18-1140-53）
搅拌机MM 400（Retsch）
Vortex Genie 2（科学工业）
移液管（1-5,000μl）（Gilson）
离心机Biofuge fresco（Heraeus Instruments GmbH）
Nanodrop分光光度计（VWR International，Peqlab）
Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Module（Bio-Rad Laboratories，目录号：1658008）
缓冲罐和盖（Bio-Rad Laboratories，目录号：1658040）
Mini Trans-Blot Module（Bio-Rad Laboratories，目录号：1703935）
自动射线照相机
FUSION SL-4 3500.WL（化学发光系统）（PEQLAB）
CCD相机FUSION 4MP（VWR International，Peqlab）
轨道振动器3015（GFL）
Shaker（INFORS AG）
加热块（Gebr.Leebisch GmbH& Co.KG Labortechnik）

软件

Fusion BIO-1D软件

程序

注意："配方"部分介绍了缓冲液，溶液和SDS凝胶的制备

重组蛋白过表达和蛋白质纯化
1. 对于大肠杆菌中的构巢曲霉（Aspergillus nidulans）蛋白的表达（这里：Rosetta DE3）接种5ml LB预培养物，补充有适当的抗生素，在37℃下孵育过夜搅动。
2. 第二天早上，使用1毫升的预培养在补充适当的2L烧瓶中接种1L LB 抗生素。孵育培养物在37℃，?220 rpm搅拌2 ?到3小时，直到OD 600达到0.6-0.7（取决于大肠杆菌菌株）。 OD 600可以用UV分光光度计通过取1ml等分试样来测定 ?的针对LB空白样品测量的培养物
3. 当OD ₆₀₀时 ?0.6-0.7，向培养物中加入1ml 1M IPTG以诱导过表达。将烧瓶转移至室温或16℃，没有超过20小时和150-180rpm搅拌
4. 转移文化至1L离心瓶，其应在冰上预冷却然后在4℃下以4,000rpm离心30分钟。
5. 弃去上清液，保持沉淀在冰上。用5-10ml冰冷的亲和缓冲液重悬沉淀
6. 将重悬的颗粒转移到50ml管中，并在4,000rpm，20分钟，4℃离心。
7. 弃去上清液，将沉淀储存于-80℃
8. 对于蛋白质纯化，在冰上融化沉淀物裂解，亲和和洗脱缓冲液。过滤器使用缓冲器过滤器和除气系统与MicronSep过滤器
9. 混合用每克沉淀物10ml冰冷的裂解缓冲液沉淀，并重悬上下移动（防止气泡并将溶液保持在冰上）
10. 把猎鹰放在一个盒子或格拉斯冰和超声的样品持续约8-10轮30秒，70％功率和1分钟暂停每轮之间。注意，在此期间不会形成气泡超声处理和样品不变暖。
11. 将裂解的细胞转移到SS34离心管中，并在20,000 rpm，30分钟，4℃离心
12. 在离心过程中，用脱气的方法清洗?KTA泵和柱 ?20％乙醇溶液和脱气的Millipore水中并平衡亲和力（泵A）和洗脱（泵B）缓冲液。
13. 将上清液转移到超级环，将环连接到?KTA。
14. 设置?KTA运行的参数（按下限制，流量，等）根据制造商的建议。通过设置启动运行流速至0.5ml/min并按压注射。可以收集流过。当超级环路为空时，从注入切换到加载。然后用亲和缓冲液，只要UV再次达到基线
15. 应用a 在30分钟内梯度为0-50％洗脱缓冲液并收集流过 ?以2ml级分。感兴趣的蛋白质在此期间应洗脱梯度或当100％洗脱缓冲液应用于柱时。然后?KTA系统和色谱柱应用脱气洗涤 Millipore水和脱气的20％乙醇溶液
16. 馏分 ?可以通过SDS PAGE分析含有目的蛋白质的蛋白质。因此，取20μl样品，加入10μl3x负载染料，变性 ?在95℃下5分钟，然后在12％SDS PAGE上加样
17. 结合所有适当量的目标蛋白质和浓缩物的级分如果需要（例如减少音量）。
18. 在SEC缓冲液中平衡?KTA和尺寸排阻色谱柱。
19. 将蛋白质样品在13,000 rpm离心10分钟，并将上清液注入样品环
20. 以0.35ml/min流速开始运行并按压注射。收集流过并通过SDS PAGE分析峰级分。然后结合包括目标蛋白质的级分，浓缩溶液并储存在-20°C。
制备蛋白粗提物
1. 取100毫升高压灭菌的基本培养基（MM）在300毫升的buffled falsks 并根据 A添加补充。构巢曲霉菌株。接种 ?1×10 6孢子/ml培养基并在37℃下孵育20小时照明和120-150rpm搅拌
2. 收集菌丝体漏斗与miracloth过滤器。用50-100ml 0.96％ NaCl溶液，然后取含有菌丝体的miracloth过滤器 ?并在纸巾之间擦干
3. 转移干菌丝体（取1厘米硬币大小的mycel）到2毫升反应管，并放入液氮。
4. 在液氮中预冷却搅拌机的反应管支架，少量注入聚苯乙烯泡沫塑料盒中。
5. 在每个管子上加两个金属球，将管子放入支架中
6. 关闭夹具并将它们组装到搅拌机上。将程序设置为1分钟，频率设置为30 /秒，然后按开始。
7. 用一点液氮将管夹再次转移到箱子中，以防止解冻。
8. 取出带有强力磁铁的金属球。然后转移研磨菌丝体至新的2ml管，并将管再次置于液体中氮。
9. 将所有管放在冰上，立即打开他们。加入300μlB *缓冲液并涡旋约1分钟
10. 离心30分钟，13,000 rpm，4℃
11. 转移上清液到新鲜的1.5ml管，离心再次10分钟，13,000rpm，4℃。如果仍有颗粒，将上清液转移至新鲜的1.5ml管中。
12. 测量蛋白质浓度与Nanodrop。防止蛋白聚集形成，不存储长于1周的粗提取物在-20℃ （在相同或次日进行deneddylation测定）最佳）。
丁二烯基化测定
1. 蛋白质粗提取物的csn 缺失和野生型菌株作为neddylated和去甲二烯基化的卡蛋白源。重组构巢曲霉 CSN蛋白是用于补充缺失。如果需要，解冻所有蛋白质溶液，在4℃下以13,000rpm离心10分钟（不冻结并融化蛋白质溶液超过2-3倍的蛋白质形式聚集体）。转移上清液到一个新的管。重新测量使用Nanodrop浓度
2. 对于每个反应，混合80μg的 ?蛋白质粗提物与8μg重组蛋白，100mM DTT和B * ?缓冲液至1.5ml反应管中的最终体积为30μl（表1）。作为对照，制备没有重组蛋白的相同反应。在37℃孵育30分钟和120rpm搅拌。
  
  表1.移液方案（示例）
3. 向每个反应中加入15μl3x SDS样品缓冲液，混合，在95℃变性 ?5分钟，然后在冰上冷却1分钟。闪光旋转样品在台式离心机中3-5秒
4. 准备12％SDS凝胶
5. 加载10微升的每个样品在凝胶上，并使用3.5微升的页面尺预染蛋白梯度作为大小标准。使用1x运行缓冲区运行 ?电泳。施加120 V，直到蛋白质达到解决 ?凝胶，然后将电压升至150-180 V，直到25 kDa谱带 ?页面标尺跑出凝胶。
6. 停止迁移和小心地将凝胶转移到western印迹装置。组装根据制造商的建议和as 如图1所示。关闭带有无色位点的盒式磁带在放置后将其转移到小转染印迹中心核中进入填充有转移缓冲液的电泳室。的蛋白质可以在100V和适当时印迹至少1小时 ?冷却缓冲液或在35V过夜。
  
  图1.蛋白质印迹装配。用于西方杂交的印迹装配顺序的示意图
7. 拆开印迹并用封闭溶液在室温下温育1小时并轻轻摇动覆盖膜
8. 弃去封闭溶液，将膜分成两部分片段在70 kDa页尺子带（图2）。添加主要抗体α-Nedd8或α-CulA（在封闭溶液中稀释1：1,000）至上膜。作为加载控制初级抗体α-Tub或 α-Act（在封闭溶液中稀释1：1,000）可以加入到下层膜部分。在室温下孵育1小时，温和搅拌
  
  图2.蛋白质印迹膜。虚线指示膜需要被切割以便发展加载对照（肌动蛋白或微管蛋白?40kDa）与CulA同时或Nedd8抗体（信号?100kDa）
9. 取出一抗，并在室温下用1x TBST洗涤膜3×10分钟，轻轻搅拌
10. 加入第二抗体α山羊兔上部膜和 α-山羊小鼠（两者在封闭溶液中为1：1,000）至下膜在室温下温和搅拌1小时
11. 去除次级抗体，并用1x TBST洗涤膜3×10分钟缓冲液在室温下轻轻搅拌
12. 对于信号检测新鲜制备检测溶液。然后混合检测溶液A与检测溶液B在膜上室温2分钟温度和温和搅拌。随后将膜放入 ?塑料箔，并通过放射自显影盒运输融合成像系统（重要：打开PC和融合成像系统之前就准备好使用，因为相机需要约10分钟用于冷却）。
13. 点击"开始" 预览'，将膜放入设备，单击'设置'→ '敏感度'→'超级敏感度'→'自动曝光'（需1-4分钟检测适当的信号）。将图像另存为TIF文件（也自动保存为STB文件）。
14. 使用Fusion BIO-1D软件分析信号如下：
  1. 点击"打开图片"，然后选择图片。点击"光密度"
  2. A-频道定义：点击"新频道 ?（图3）。在信号周围拖动以定义要分析的区域。点击"全部选择""→"下一步>>'。
  3. B-背景扣除：点击"滚动球"→"下一步">>'。
  4. C-点分隔：点击"添加分隔"或使用指定的分隔并通过拖动光标将括号放在带边界附近（图4）。点击"下一步">>'。
  5. 取消'浓度'， "（只有" "具有刻度），"高度"，"区域（图5）。按" Excel "按钮。将打开一个Excel窗口表示限定边界内的像素强度的体数据（图6）。考虑野生型信号和进一步量化信号加载控件。
  图3. BIO-1D，A-Lane定义。屏幕截图 ?BIO-1D软件显示一个绿色的内衬盒，可以拖动来定义 ?分析区。
  
  图4. BIO-1D，C-spot分离。屏幕截图的BIO-1D软件显示带边界的分离放置括号
  
  图5. BIO-1D，数据导出到Excel ?的BIO-1D软件显示的步骤，其中Volume的值必须选择导出到Excel
  
  图6. BIO-1D，Excel中的数据。Excel表格中包含已定义边界内像素亮度值的屏幕截图。

代表数据

图7显示了类似于Beckmann等人（2015）中所示的体外脱离子化测定的典型结果。通常大多数cullins在野生型中是deneddylated。这在来自野生型（wt）的粗提取物的western杂交和定量中是可见的，其中Nedd8抗体在?100kDa处给出弱信号，CulA杂交对于去甲二基化CulA（CulA，**）具有强信号，对于Nedd化的CulA（CulA-Nedd8，*）（图7）。相比之下，csn 缺失菌株的粗提取物显示增加的Nedd化的CulA量，其不能通过向缺失菌株中添加相应的重组CSN亚基来补充。唯一的例外是其中CulA主要是deneddylated，如在野生型中，当重组 cnE 被添加到csnE缺失粗提取物时。只有这样，CSN似乎是活跃的。
相对于装载对照和Nedd8相对于野生型来定量信号。对于CulA信号，计算Nedd化的CulA与非Nedd化的CulA的比例。

图7. 体外 deneddylation测定的实例：CsnE可以恢复CSN的deneddylation活性。用非重组CSN蛋白孵育的构巢曲霉粗提物。 A.将膜与α-Nedd8抗体一起孵育，导致对于wt和ΔcsnE+ CsnE的弱信号，对于具有或不具有?100kDa的重组蛋白的所有其他csn 缺失菌株的强信号。使用α-Tub抗体作为加样对照。 B.用α-CulA检测下划线的是来自（A）的结果，其中在ΔcysE +重组CsnE中的Neddylated CulA（*）与deneddylated CulA（**）的比例与野生型并与所有其他样品相比反转。使用BIO1D软件（Peqlab）定量结果。

笔记

该协议的用户应该有使用?KTA系统进行蛋白质纯化的经验或协作组。
对于可靠的数据，应进行至少三次生物重复。这对计算误差条也很重要。使用具有以下公式的Excel计算平均值和标准偏差：

以表示数据集的每个值的σ作为标准偏差， x _{i >算术平均值， n 总数据点，Σ -}

食谱

溶菌酶培养基（LB）培养基
1％（w/v）蛋白胨/胰蛋白胨 0.5％（w/v）酵母提取物
1％（w/v）NaCl 高压灭菌并在使用前补充抗生素（1：1,000）
裂解缓冲液
500 mM NaCl
50mM Tris（pH8.0）使用前加入：1mM PMSF
亲和缓冲区
500 mM NaCl
50mM Tris（pH8.0）在HisTrap柱
的情况下为5％（w/v）咪唑
HisTrap的洗脱缓冲区
500 NaCl
50mM Tris（pH8.0） 500mM咪唑
GSTrap的洗脱缓冲区
500 NaCl
50mM Tris（pH8.0） 20mM谷胱甘肽
大小排除缓冲区（SEC）
120 mM NaCl 20mM Tris pH 8.0 1 mM DTT
1mM EDTA
5％（v/v）甘油
最小培养基
1％（w/v）葡萄糖 1x AspA
2mM MgSO 4 1个微量元素
50x AspA
3.5 M NaNO 3 3/
350 mM KCl
560mM KH 2 PO 4 sub/
用KOH（?30mL 5M KOH需要！），高压釜
调节到pH 5.5
微量元素
18μMFeSO 4
174μMEDTA
76μMZnSO 4
178μMH sub 3 BO ₃
25μMMnCl 2
7.1μMCoCl 2
6.4μMCuSO 4
6.2μMNa 2 MoO 4 sub / 无菌过滤器
B *缓冲区
300 mM NaCl
10mM Tris-HCl（pH7.5） 0.5mM EDTA 0.2％（v/v）NP-40
10％（v/v）甘油在使用前添加：
1mM PMSF
2 mM DTT
5 mM E64
100μl/10ml完全蛋白酶抑制剂混合物
3x SDS样品缓冲液
250mM Tris-HCl（pH6.8）
15％2-巯基乙醇 30％甘油
7％SDS
0.3％溴酚蓝
12％SDS凝胶
对于2种凝胶，将以下溶液混合在50ml反应管中：
解决凝胶：
5 ml 2x分离缓冲液
4ml 30％丙烯酰胺 1ml H 2 O 2 / 150μl10％APS
15μlTEMED
1. 倒置溶液，然后在玻璃板之间填充。
2. 在凝胶顶部加入约1ml 100％异丙醇以防止气泡。
3. 让凝胶干燥?10-20分钟。
4. 然后小心地除去异丙醇。
5. 使用whatman纸去除剩余的液滴。
6. 然后将所有用于堆积凝胶的组分混合在50ml反应管中
堆叠胶：
2ml 2x堆积缓冲液
0.5ml 30％丙烯酰胺 1.5ml H 2 O 2 / 60微升10％APS
7.5μlTEMED
1. 倒置管，然后将堆叠溶液填充到溶解凝胶上至顶部。
2. 然后将comps小心地放入堆叠凝胶。
3. 让凝胶干燥10-20分钟。
2x解析缓冲区
0.75M Tris-HCl（pH8.8）
0.1％（w/v）SDS
2x堆叠缓冲区
0.25M Tris-HCl（pH 6.8）
0.1％（w/v）SDS
10x SDS运行缓冲液
250 mM Tris-base
2.5 M甘氨酸 1％（w/v）SDS
使用ddH _{2 O缓冲液稀释至1x工作溶液}
10 x转移缓冲区
250 mM Tris-base
1.92M甘氨酸 0.2％（w/v）SDS
使用ddH _{2 O缓冲液稀释至1x工作溶液}
10x TBST（Tris-缓冲盐水Tween 20）
100mM Tris-HCl（pH8.0） 1.5 M NaCl
0.5％（v/v）Tween-20 用ddH 2 O缓冲液稀释至1×工作溶液
封锁解决方案
5％奶粉溶于1x TBST缓冲液中
检测溶液A（使用前准备新鲜）
9ml ddH 2 O 2 / 1ml Tris-HCl（pH8.5） 100μl250mM鲁米诺（溶于DMSO的储备溶液，避光，-20℃保存） 44μl400 mM对香豆酸（溶于DMSO中的储备溶液，防光，-20°C储存）
检测溶液B（在使用前准备新鲜）
9ml ddH 2 O 2 / 1ml 1M Tris-HCl（pH8.5） 6.15μl30％H 2 O 2 sub。
完全蛋白酶抑制剂鸡尾酒
将1?片溶于1ml B *缓冲液中

致谢

该方案改编自先前发表的研究（Beckmann等人，2015）和前体实验（Christmann等人，2013; Harting等人，/em>，2013; von Zeska Kress et al。，2012）。我们感谢Elena Beckmann博士的支持和建议，以及Gabriele Heinrich的优秀技术援助。我们也感谢Sabine Reen和Josua Schinke仔细校对手稿。这项研究得到了在SFB860内的德国Forschungsgemeinschaft（DFG）的支持。

参考文献

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