材料和试剂

显微镜载玻片
盖舌
在期望阶段（在出生后第1天（P1）和21（P21）之间）的小鼠
1x PBS
Triton X-100
4％多聚甲醛（PFA）（通过在1x PBS中稀释粉末制备）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A-8022）
Hoechst 33258溶液（Sigma-Aldrich，目录号：94403）
Mowiol（Merck Millipore Corporation，Calbiochem ，目录号：475904）
Prolong Gold抗衰减试剂（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probe ^TM，目录号：P36934）
ZO1（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：61-7300）}
γ-微管蛋白[GTU-88]（Abcam，目录号：ab11316）
FGFR1OP（FOP）（Abnova Corporation，目录号：H00011116-M01）
β-连环蛋白（BD，目录号：610153）
FoxJ1（eBioscience，目录号：14-9965）
乙酰化-α-微管蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：T6793）
二抗
1. 抗兔A647（Invitrogen，目录号：A21244）
2. 抗小鼠IgG1A568（Invitrogen，目录号：A21124）
3. 抗小鼠IgG2b A488（Invitrogen，目录号：A21141）
4. 抗小鼠IgG1 A488（Invitrogen，目录号：A21121）
5. 抗小鼠IgG2b A568（Invitrogen，目录号：A21144）
一抗和二抗（见配方）

设备

解剖工具包括镊子（Zillow，Dumont，型号：55）和超细微刀（Fine Science Tools，目录号：10316-14）
共聚焦显微镜（OLYMPUS，型号：Fluoview FV1000）
装备有100×油物镜（HC-PL-APO; NA 1.40; STED白）和592nm耗尽激光器的STED显微镜（Leica Microsystems，型号：SP8 3x STED）

软件

Biotool软件（Boutin等人，2014）

程序

这里描述的一般程序在此适合于描述适合于从P1到P21小鼠的侧壁整个支架染色室管膜细胞。然而，组织的最后一个亚解剖步骤必须在P5以前的小鼠的染色之前和P5以下的小鼠的染色之后进行，以确保最佳结果。

在小鼠颈椎脱位后，从颅骨中取出脑。
在室温下在1x PBS中解剖大脑以显示心室侧壁（图2）[包括视频的协议被提供 Mirzadeh et al。（2010）]。
通过浸没固定整个安装 ?在500μl新鲜的4％PFA-0.1％Triton X-100溶液中12分钟温度（RT）。
在室温下，在搅拌下，在1x PBS-0.1％Triton X-100（1ml）中洗涤3次10分钟。
对于P5以下的组织：LWWM的解剖在1x PBS中分离侧壁和下面的纹状体[参见 Mirzadeh et al。（2010）]。
将整个安装在幻灯片上，室内表面朝上。
添加7-8滴Mowiol（用于样品的共焦观察）或 ?长期安装介质（用于样品的STED观察）直接整个座架。
将盖玻片放在样品上。
保持幻灯片在室温，保护免受光，至少24小时成像。

代表数据

图1。侧壁中室管膜细胞的平面组织 A.小鼠前脑的示意图，描绘侧脑室侧壁的定位。虚线方框突出显示了考虑用于分析室管膜平面极性的感兴趣区域。公元前。方案代表感兴趣区域中室管膜细胞的平面组织。 B.在细胞水平，室管膜纤毛聚集在一簇（红色虚线），其定位在顶端表面的中心（红色箭头）。睫状鞭毛（小黑箭头）是协调的。单个睫毛打击的总和产生簇打打方向（粗灰色箭头）。在单个细胞中，绒头定位的方向与簇绒方向（C）相关。在组织水平，搏动方向（灰色箭头）和睫状体束（红色箭头）的定位在相邻的室管膜细胞之间协调。 D-E。个体室管膜细胞组织的横向（D）和"en面"（E）视图的示意图。 D.多纤维素轴突产生于垂直锚定于细胞顶端表面的基底体（BB）（绿色）。 BB显示极化附录，例如指示纤毛的有效搏动方向（小黑色箭头）的基底脚（红点）。 E.从顶视图观察纤毛BB显示所有的室内极性特征

图2. LWWM准备的解剖步骤。 LWWM制剂允许"en面"观察室管膜细胞。 A.从头骨中取出后的脑。 B.使用微型手术切割两个半球之间的大脑（红色虚线）。 C.取出小脑（红色虚线）。 D-F。使用micropapel显示海马（红色虚线）。 G-H。插入微脉冲在心室（箭头），以去除海马和内侧心室壁。 I.沿着红色虚线除去皮质壁。 J.整个安装准备固定，侧壁由红色虚线勾勒出来。

图3.在P1，P4，P5和P21LWWM共聚焦（A-E）和STED（F）图像上染色的实施例。 LWWM在P1处染色A.ZO1（绿色）和乙酰基-α-微管蛋白（红色）。 B.PoxJ1（绿色）和DAPI（蓝色）。 C.在P??21的β-连环蛋白（绿色）和乙酰基-α-微管蛋白（红色）。 D.β-catenin（绿色）和P - 微管蛋白（红色）。 E-F。 FGFR1癌基因合作伙伴（FOP）。比例尺：A-B为10μm，C-D为15μm，E-F为2.5μm

图4.侧壁中室管膜细胞的平面组织分析（A，B，C）。在P21 LWWM上的ZO1（白色），FGFR1癌基因合作伙伴（FOP，绿色）和γ-微管蛋白（红色）的三重免疫染色允许在单个样品中观察细胞和组织水平的翻译和旋转极性。 A.显示组织组织的大场图片。 B.放大（A）中标有*的单元格。 C.放大BBs补丁从细胞展示在（B）。使用Biotool1软件（描述于Boutin等人（2014）]的ZO1/FOP /β微管蛋白三重染色的分析允许在BB，细胞和组织水平上定义极性参数。 C'。个体纤毛极性的定义：每个黑色矢量代表单个BB的旋转极性轴，其定义为从FOP（绿色）到μ-微管蛋白（红色）正点的方向。生物工具软件计算贴片的平均BB取向，以限定与单个细胞（灰色箭头）的拍打方向对应的细胞旋转极性轴。 B'-B"。细胞水平极性轴的定义：细胞（绿色）和BB补丁（红色）的轮廓。（B'）中的灰色向量表示如C'所示定义的单元的旋转极性轴。（B"）中的红色箭头表示被定义为从细胞中心（绿色交叉）到BB斑块中心（红色叉）的方向的细胞的平移极性轴。 A'-A"。组织水平极性分析：为每个细胞定义平移和旋转极性轴，并与场的平均方向（黑色和红色粗箭头）进行比较。比例尺：A为15μm，B为2.5μm，C为1μm。

笔记

新鲜制备的4％PFA等分试样可以在-20℃下储存至多一年，并在固定之前解冻。
短的固色时间是良好染色的强制性。 12分钟的固定足以固定大和小的组织，同时保留结构并给出最好的结果。我们建议不要超过20分钟固定室管膜观察。

食谱

具有相应二级抗体的一级抗体

表1.主要和次要抗体列表

抗体	同种型	参考	稀释	二抗
ZO1	兔子	Invitrogen 61-7300	1：600	抗兔A647
γ-微管蛋白[GTU-88]	小鼠IgG1	abcam ab11316	1：400	抗小鼠IgG1 A568
FGFR1OP（FOP）	小鼠IgG2b	Abnova H00011116-M01	1：2,000	抗小鼠IgG2b A488
β-连环蛋白	小鼠IgG1	BD Transduction Laboratories 610153	1：1,000	抗小鼠IgG1 A488
FoxJ1	小鼠IgG1	eBioscience 14-9965	1：2,000	抗小鼠IgG1 A488
乙酰化α-微管蛋白	小鼠IgG2b	Sigma T6793	1：1,000	抗小鼠IgG2b A568

致谢

本文中描述的方法已经优化用于室管膜细胞组织的检测，并且基于先前描述的方案（Mirzadeh等人，2010）。协议的原始版本已在（Boutin等人，2014年）中描述。作者希望感谢Spassky实验室（ENS，巴黎）介绍LWWM解剖方法。 CB是"La Ligue Nationale Contrele Cancer"博士后研究员的接受者。 HC承认来自国家民用航空局（ANR-13-BSV4-0013-01-ATMIR）的资金。这项工作得到了法国国家研究机构通过"未来投资"计划（法国 - 生物图像，ANR-10-INSB-04）的支持。

参考文献

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