材料和试剂

1ml注射器（Henke Sass-Wolf，目录号：5100.200V0）
针（16G，40mm）（Premier Healthcare& Hygiene，BD microlance，目录号：300637）
50ml Falcon管（Sigma-Aldrich，目录号：T2318）
玻璃试管（Carl Roth GmbH + Co，目录号：HA79.1）
土壤（FrühstorferPikiererde T型土）和罐
Ustilago maydis 菌株
注意：将U.disdis野生型或任何转基因株作为甘油原液保存在-80℃下以长期储存。每个应变可以在PDA平板上检索。
玉米种子（例如品种Early Golden Bantam或Gaspe Flint）
注意：玉米品种Early Golden Bantam是标准的玉米品系，需要大约4周的花卉开关和雄性花序的发育。玉米品种Gaspe Flint是一种突变体玉米，其在35-38天内完成其生命周期，因此在播种后约15天具有早期花卉开关，雄性花序发育。因此，这种品种适用于U.canis的花卉感染。
酵母提取物（BD，Difco，目录号：210934）
蛋白胨（BD，Difco，目录号：211830）
蔗糖（Carl Roth GmbH + Co，目录号：9097.2）
双蒸水
2.4％土豆葡萄糖肉汤（BD，Difco，目录号：254920）
2％琼脂（BD，Difco，目录号：214010）
YEPS _{L medium（从Tsukada 修改，1988）（参见配方）}
马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板（见配方）

设备

温室
锥形烧瓶（250ml）
一次性比色皿（Carl Roth GmbH + Co，目录号：Y195.1）
孵化器[例如 Certomat BS-1（B. Braun Biotech International）]
离心机（Thermo Fisher Scientific）
分光光度计[例如 Ultrospec 3000 proUV/Visible（GE Healthcare）]
刀具

程序

玉米植物的栽培
1. 玉米品种（可能有不同长度的发育开关）（ cv Early Golden Bantam或cv Gaspe Flint（或您的玉米选择的品种）在20cm的圆形罐中生长，4粒种子每个罐以相等的间距。将罐保持在温度下控制温室，具有以下条件（14小时/10小时亮/暗循环，28/22℃。取决于生长行为植物，必须确保正确的阶段用于感染。幼苗感染在三叶期定期进行。流苏当流苏花分生组织在有丝分裂中时进行感染在花粉形成之前的阶段（流苏大小为1-1.5cm）
2. 都 ?品种可以在土壤中在具有4的约15cm圆形花盆中生长 ?植物。品种Gaspe Flint主要用于流苏（男性花序）感染，因为他们有早期花开关（15 天）与标准玉米（早期金黄矮脚鸡）相比约。 4周）。
U。 maydis 文化准备
1. U。 maydis 菌株在新鲜PDA平板上生长（不超过1周）用于制备预接种物。将菌株接种在a ?3ml YEPSL培养基中并在无菌玻璃试管中孵育过夜在28℃下以200rpm振荡。
2. 预接种物（40μl）用于在250ml无菌培养基中接种大培养基（50ml）锥形瓶中，然后在28℃下以200rpm振荡温育 ?约10-12小时。
3. 然后当光学时收获培养物 ?密度（OD 600）达到0.6至0.8（培养物不应低于） 0.5，也不高于1.0）。这个范围的OD确保了em的生长。可能在活跃分裂阶段的孢子。然后培养在50ml Falcon管中在900×g离心5分钟温度
4. 将收获的细胞重悬浮并洗涤无菌水除去所有的培养基。步骤B4 重复离心。
5. 然后将细胞重悬浮移液或在水中涡旋至OD 600 = 1.0。该接种物用于 ?感染玉米植物注意：对于野生型U maydis菌株（例如FB1和FB2是两种相容的配对类型）在OD ₆₀₀ = 1.0时以等体积混合在一起成功感染。对于solopathogenic菌株SG200（K?mper ?et al。，2006）或在由此背景产生的任何突变体的情况下一个文化菌株可以用作接种物。

U。 maydis 毒力测定
在幼苗：

幼苗感染用通常显示的玉米植株进行 ?三个幼叶阶段。对于大多数玉米品种当达到这个发育阶段时植物是7天大 1）。

图1.玉米植物cv。早期黄金矮脚鸡和他们接种U。 maydis 。 A.玉米幼苗在三叶期是 ?接种U。 maydis 用于幼苗感染。注射器指向叶片旋转的中心。 B.接种玉米植物 ?与。 maydis 为流感感染。注射器撞在里面的流苏 ?茎。插图：玉米穗在真菌感染阶段。
接种感染通过注射器用300-500μl的进行 ?接种细胞悬浮液进入叶轮内部。的注射部位选择约。在土壤上方1厘米，约为2.5厘米 ?至基部植物分生组织3cm以上并且是幼年茎。
第一叶片和第二叶片的叶鞘和叶片浸入螺旋中的第三和第四叶片被刺穿通过注射器一半到杆柱的中心，这后来在症状发展后显示感染标记
一旦在叶子的内部叶子上看到接种物，就知道幼苗被成功感染
将植物保持在28/22℃的受控生长条件下。成功的感染会导致4-6 dpi后出现肿瘤。

对通过人工接种幼苗形成的肿瘤进行评分 ?（K?mper等人，2006）的改进的标准方案在12dpi下进行，如表1所示和下面显示的（图2）。

图2.幼苗（左）和雄穗组织中的形态症状（右）玉米感染后的U。 maydis 。拍摄了照片 ?10 dpi。

表1.感染的玉米幼苗的症状分类

植物症状	描述
无症状	植物没有感染的迹象
含氯	植物显示受感染的叶子（第三叶和更小的叶）的褪绿变色
小肿瘤	植物的最大肿瘤为<1.5mm
正常肿瘤	植物的肿瘤直径为2-4mm
重肿瘤	非常强的肿瘤导致梗阻生长迟缓
死厂	植物是死的，感染后感染后看起来坏死。 maydis

在流苏（男性花序）：

流感感染在植物花开关后立即进行当雄穗仍在有效分裂有丝分裂期。在cv。 Gaspe Flint这通常是在15天后和大约4周后简历。早播金万丹播种后（见图1）。
流苏感染也使用基于注射器的方法进行。不成熟 ?流苏位置被识别，而不通过按压切割植物茎。嵌入茎中的雄穗分生组织具有空气空间包围它使茎干燥。上面的流苏哪终止苗，叶鞘重叠，但没有固体中心，该区域包含发育中的花序。
在注射之前，用锋利的刀切开一个或两个植物从基地，了解缨子分生组织的位置 ?嵌入叶子的轮生。
基于这个高度，流苏位置在所有植物上大致确定。标准注射方案包括接种1ml全部注射的培养物同时，注意只穿透植物的一半直径。这确保接种到整个花分生组织和填充流苏周围的空气空间。
将植物保持在28℃的受控温室中，其在8-10dpi后显示成功的肿瘤外观（图2）

流感病毒症状在感染后10天评分在cv。 Gaspe Flint和14天后在cv。早期黄金矮脚鸡由前述的评分方案（Schilling等人，2014，表2）如下所示。

表2.感染的玉米流苏症状的分类

流苏症状	描述
肿瘤<50％的流苏，小	流苏的一部分转化为2-4毫米范围内的小肿瘤
肿瘤<50％的流苏，大	小于一半的流苏被转化为大于4mm的大肿瘤
肿瘤> 50％的流苏，小	整个雄花花序被小肿瘤覆盖。
肿瘤> 50％os穗，大	完整的雄穗通过U转变成重的肿瘤。 maydis
流涎生长阻碍了	流苏在发育时间被捕它被感染的点和这1-3厘米阻碍流苏变成肿瘤。

食谱

YEPSL介质
该培养基由在双蒸水中的0.4％（w/v）酵母提取物，0.4％（w/v）蛋白胨，2％（w/v）蔗糖组成。
PDA平板
PDA培养基由2.4％土豆葡萄糖肉汤和2％琼脂在双蒸水中组成。高压灭菌后约。每个培养皿中有18ml培养基

致谢

我们的工作由马克斯普朗克学会，德意志研究所（DFG），德国学术会议（DAAD）和植物科学卓越丛集（CEPLAS）资助。该协议改编自K?mper等人（2006）; Schilling （2014年）和Redkar 等人（2015年）。

参考文献

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