材料和试剂

组织培养皿（Corning，目录号：353003）的标准10cm TM
注射器过滤器0.45μm过滤器（Corning，目录号：CLS431225）
22Rv1前列腺癌细胞（ATCC，目录号：CRL-2505）
NOD.Cg- /SzJ（NSG ）小鼠（Jackson Lab，目录号：00557）
Phoenix-Ampho cell（ATCC，目录号：CRL-3213）
pLenti CMV Puro LUC（w168-1）（Addgene，目录号：17477）
辅助pCMV-VSV-G（Addgene，目录号：8454）和pMD2.G（Addgene，目录号：12259）
One Shot Stbl3胜任力大肠杆菌（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，目录号：C7373-03）
LB肉汤培养基（Thermo Fisher Scientific，BioReagents ^TM，目录号：BP1426-2）
氨苄青霉素（Sigma-Aldrich，目录号：A9393）
QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN，目录号：27106）
RPMI 1640 Medium（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：11875119）
Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS）1x（Corning，目录号：21-031）
jetPEI DNA转染剂（Polyplus转染，目录号：101-10N）
青霉素 - 链霉素抗生素（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15140122）}
Polybrene （Santa Cruz Biotechnology，目录号：134220）
异氟烷（Baxter，目录号：1001936040）
生长因子减少（GFR）基底膜基质（Corning，目录号：354230）
D-荧光素（PerkinElmer，目录号：770504）

设备

Thermo-block（Thermo Fisher Scientific，型号：Isotemp 数字和模拟干浴培养箱）
摇床孵育器（Eppendorf AG，New Brunswick Scientific，型号：Innova 44R孵育器/振荡器）
台式微量离心机（Eppendorf AG，型号：离心机5415R）
分光光度计（Thermo Fisher Scientific，型号：SPECTRONIC ^{200分光光度计）}
孵育器（Thermo Fisher Scientific，型号：Heracell 150i）
Vortex（Scientific Industries，型号：Vortex Genie 2）
IVIS光谱成像仪（PerkinElmer，型号：IVIS Spectrum临床前体内成像系统）

软件

Caliper LifeScience Living Image 成像软件（PerkinElmer，目录号：128110）（Lumina/Kinetic/XR/100，Living Image V4.1）

图1.使用萤光素酶成功标记细胞并在体内执行成像所需的步骤的示意图。

程序

细菌转化
人工构建的质粒是用于将外来DNA引入细菌细胞的最常用的载体。在该方案中，我们使用商业质粒Lenti CMV Puro LUC，其含有萤火虫荧光素酶基因，并转化到Stb13感受态细胞的培养物中。
1. 转移50微升Stbl3感受态细胞在放置在冰上的1.5毫升的Eppendorf管
2. 将100ng和500ng质粒加入试管中并重悬与Stbl3感受态细胞（移液器重悬，不使用涡旋）。
3. 孵育管在冰上30分钟，轻轻重悬每10分钟。
4. 将管在热块中在42℃下精确45秒，并立即放回冰中2分钟。
5. 加入800μl没有抗生素的LB培养基管，轻轻地用移液管重悬样品（不要使用涡流）。
6. 在摇床培养箱中以37℃速度200rpm培养细菌2-3小时
7. 将100μl转化混合物在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB-琼脂平板上平板
8. 将板在孵育器中37℃过夜
9. 挑取单个菌落并接种到含有50ml LB-培养基+100μg/ml氨苄青霉素的烧瓶中。
10. 在37℃下在振荡器孵育器速度200rpm中孵育过夜。
DNA提取
有几种方法可用于纯化质粒DNA，这取决于细菌培养物的大小及其相应的质粒产量，以及可从不同制造商获得的几种试剂盒。在这里，我们使用QIAprep Spin Miniprep Kit进行小量制备（miniprep），其允许从转化的细菌中分离最多20μg质粒DNA的小规模样品。简言之，在该方案中，从细菌中分离DNA依赖于柱的使用和离心步骤，其中DNA被剪切，提取和沉淀。按照制造商的协议。
DNA转染到病毒包装细胞中根据质粒，可以使用几种包装细胞来产生所需的病毒。在这个协议中，我们使用Phoenix-Ampho细胞，这是第二代逆转录病毒生产细胞系，当辅助DNA（CMV和DMV）存在时，也能够长期稳定生产慢病毒。辅助DNA编码增加病毒复制和包装的病毒基因。
1. 种子3×10 6个Phoenix-Ampho细胞在8ml补充有10％ FBS和1％PenStrep在10cm 2培养板中转染前24小时。
2. 在第一个1.5ml Eppendorf管中，加入6μgDNA，每种3μg 辅助（CMV和DMV），并填充至250μl的150mM NaCl（每个样品至 ?转染）。
3. 在第二个1.5ml管中加入24μl的jetPEI和226μl的150mM NaCl（每个样品进行转染）。
4. 涡旋管10秒。
5. 加入Jetpei + NaCl的Eppendorf管与DNA和涡流10秒。
6. 在室温下孵育混合物15分钟。
7. 取出板的培养基，加入9.5ml新鲜RPMI补充 ?10％FBS和1％PenStrep到Phoenix-Ampho细胞（参见步骤C1）
8. 逐滴加入500μl混合物（步骤C5）至平板，并在37℃下孵育过夜。
9. 24小时后更换培养基并加入补充有10％FBS和1％PenStrep的新鲜RPMI
10. 48小时后收集并用0.45μm过滤器过滤介质到50ml Falcon管中。
  注意：可以测量病毒浓度之后通过连续稀释获得定量信息。可以使用各种技术来量化病毒浓度包括传统方法（例如空斑测定）和商业试剂盒（ ELISA或Q-PCR）。
病毒颗粒细胞感染
在前面步骤中产生的病毒颗粒用于感染细胞。病毒将感染具有病毒可结合的受体的细胞。因此，病毒感染的效率将极大地取决于细胞类型。在该方案中，我们用10ml培养基感染生长在10cm 2培养皿中的70％汇合的22Rv1前列腺癌细胞。
1. 向培养的细胞中加入聚凝胺，使终浓度为10μg/ml。
  注意：Polybrene是一种有效的感染试剂，用于引入病毒载体进入哺乳动物细胞。聚苯乙烯通过中和作用病毒体和细胞表面之间的电荷排斥（Davis等人， 2004）。
2. 使用5ml移液管，向培养的细胞中加入4ml过滤的病毒颗粒
3. 在250×g离心10分钟2小时5分钟。
  注意：此步骤有助于病毒与细胞表面的物理接触，提高感染效率。
4. 将细胞置于37℃，5％CO 2培养箱中18-24小时。
  注意：感染效率可能受孵育时间的影响。可以使用不同的孵育时间进行故障排除确定特定细胞类型的最有效的孵育时间。
5. 吸出培养基并加入10ml补充有10％FBS和1％PenStrep的新鲜RPMI。在37℃孵育24小时
6. 通过向培养基中加入终浓度为2μg/ml的嘌呤霉素选择感染的22Rv1前列腺癌细胞。
  注意：嘌呤霉素浓度取决于细胞类型。
7. 每3天更换含有嘌呤霉素的培养基。细胞有纳入pLenti CMV Puro LUC将在抗生素下生长选择条件。
8. 检查细胞是否掺入了荧光素酶质粒。
  注意：多种方法可用于测试成功的荧光素酶。实例是通过PCR检测荧光素酶或测量荧光素酶对D-荧光素暴露的活性（参见图2）。
将荧光素酶标记的细胞注射到免疫受损的小鼠中
在该协议中，我们进行荧光素酶标记的肿瘤细胞的皮下注射。然而，可以基于研究者的偏好来进行替代的注射位点，例如促进前列腺微环境的小鼠前列腺（正交位点）和能够增强成功植入和保持肿瘤异质性的肾下膜注射（Hidalgo et al。/em>，2014; Siolas et al。，2013）。
注意：按照机构动物护理委员会批准的方案进行所有动物程序。该协议已在我们的机构根据特定的动物护理委员会进行，并遵守所有相关的监管和机构机构，法规和准则。
1. 通过去除培养基，收获附着的细胞，用10洗涤细胞 ml 1×DBPS两次，并使用2ml 0.05％胰蛋白酶胰蛋白酶化细胞。恢复2毫升胰蛋白酶化细胞到15毫升管含有4毫升RPM1 补充有10％FBS和1％PenStep
2. 使用血细胞计数器计数细胞。
3. 混合悬浮于100μl补充有100μl细胞外基质（1:1比例）的RPMI中的10 6细胞并置于冰上。
4. 在皮下注射之前麻醉小鼠，在1L /分钟的氧气中提供5％（v/v）吸入异氟烷的室中。
5. 使用25号针和1毫升注射器，注射250微升的细胞和细胞外基质悬浮液皮下注射到侧腹免疫缺陷NSG小鼠。
生物发光成像
IVIS光谱成像仪以每秒光子数表示生物发光信号，并将其显示为强度图。发光，其是荧光素酶表达细胞发射的光子通量的结果，直接与肿瘤的大小相关，并且可以使用感兴趣区域（ROI）工具在注射部位测量。可以调整光发射图像以提供最佳对比度和分辨率，而不影响使用Living Image< i/sup>体内成像软件的定量。
1. 在1x DPBS中制备15mg/ml的D-荧光素的新鲜储备溶液。
2. 使用异氟醚蒸发器麻醉小鼠，并将它们放在IVIS Spectrum成像仪的相机箱内。
3. 运行鼠标的背景图像。
4. 放置小鼠背部躺着（腹部朝上），并注射150 ?mg/kg D-荧光素（来自步骤F1）腹膜内（ip）5分钟成像前。优选的注射区域是小鼠右腹象限。
5. 考虑到时间依赖性D-荧光素被肿瘤细胞摄取，运行顺序图像的小鼠每2分钟，直到达到发光饱和
  
  图2.图像显示了IVIS光谱成像仪和放置在相机盒内的鼠标

代表数据

图3.细胞中的荧光素酶检测多种方法可用于测试细胞感染的成功，包括但不限于：A.通过PCR和/或B的荧光素酶基因的遗传检测。测试荧光素酶活性

图4.小鼠皮下注射细胞。A.将皮肤从颈背上抬起，形成一个帐篷。 B.将针头插入帐篷底座，将其平行于动物的身体，以避免刺破下面的结构。 C.吸气以产生轻真空并确保针没有进入血管。缓慢注射细胞和细胞外基质悬浮液。

图5.生物发光体内成像。 A。具有注射荧光素的皮下肿瘤的小鼠的代表性荧光素酶时程（每2分钟）成像。 B.图示说明直到时间点8分钟，当实验决定结束时获得的整个小鼠（显示在A.中）的生物发光饱和度。

致谢

我们感谢TJ Martell基金会和安捷伦科技的支持。

参考文献

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Contag，P.R.，Olomu，I.N.，Stevenson，D.K.and Contag，C.H。（1998）。生物哺乳动物中的生物发光指示器。 Nat Med 4 2）：245-47。
Davis，H.E.，Rosinski，M.，Morgan，J.R。和Yarmush，M.L。（2004）。带电荷的聚合物通过膜电荷中和和病毒聚集调节逆转录病毒转导。生物物J 86（2）：1234-1242。
Edinger，M.，Sweeney，T.J.，Tucker，A.A.，Olomu，A.B.，Negrin，R.S.and Contag，C.H。（1999）。在动物模型中无创性评估肿瘤细胞增殖肿瘤 1（4）：303-10。
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Hidalgo，M.，Amant，F.，Biankin，AV，Budinska，E.，Byrne，AT，Caldas，C.，Clarke，RB，de Jong，S.，Jonkers，J.，Maelandsmo，GM，Roman-Roman ，S.，Seoane，J.，Trusolino，L.and Villanueva，A。（2014）。患者衍生的异种移植模型：翻译癌症研究的新兴平台 Cancer Discov 4（9）：998-1013。
Siolas，D。和Hannon，G.J。（2013）。