材料和试剂

50ml螺旋盖瓶（MonotaRO Co.，Duran，目录号：371-05-20-52）
滤纸（90mm）（MISUMI Corporation，Toyo Roshi Kaisha Ltd，目录号：00011090）
pH指示剂纸（Merck Millipore Corporation，目录号：109526）
旋转柱（Merck Millipore Corporation，目录号：UFC3 0HV 000）
用于LC-MS/MS分析的小瓶和盖（Chromacol，目录号：1030-41201和1030-42473）
高粱（高粱）在P或N缺乏下生长
注意：耐受Striga的高粱品种可从国际半干旱热带作物研究所（ICRISAT）获得。我们检查了几个高粱"杂种"品种为其SL生产，并且他们之间SL生产基本上没有定量和定性差异。
乙酸乙酯（KANTO CHEMICAL，目录号：14029-70）
在我们的实验中向每个样品中加入500pg的d 6 -5-deoxystrigol（Ueno等人，2010）
注意：内部标准（如果有）。
无水MgSO 4（KANTO CHEMICAL，目录号：25035-00）或Na 2 SO 4（Kanto Chemical，目录号：37280-00 ）
乙腈（KANTO CHEMICAL，目录号：01031-2B）
。（参见配方）。
乙腈与0.1％乙酸用于LC-MS/MS（参见配方）
含有0.1％乙酸的水用于LC-MS/MS（参见配方）

设备

漏斗（45mm直径）（MonotaRO Co.，AGJ，目录号：233-09-11-04）
锥形烧瓶（50ml）（Sansyo，Iwaki，目录号：4980FK50）
分液漏斗（100ml）（Iwaki，目录号：6402FS100R）
将蒸发烧瓶（300ml，50ml）（Sibata，目录号：371-13-68-34和371-13-68-21）
巴斯德移液管（Thermo Fisher Scientific，目录号：13-678-20C）
小台式离心机（IKA，目录号：969-65-03-01）
LC-MS/MS（AB Sciex，型号：QTRAP 5500）
UHPLC系统（Shimadzu Corporation，型号：Nexera X2）
18柱（φ2.1×150mm，2.6μm）（Phenomenex，型号：Kinetex C18）

程序

向50ml螺旋盖瓶中加入10-20ml乙酸乙酯，并测量瓶的重量。将乙酸乙酯体积调节至植物体积，使得所有植物组织用乙酸乙酯覆盖。
从2-4周龄的高粱植物收获健康的根组织（约1g FW），并立即将它们放入含有乙酸乙酯的瓶中。最好不要将根组织存储在冰箱中以避免SL的可能的降解。在高粱的情况下，SL生产由N或P缺乏促进，并且因此在营养缺乏条件下生长的植物含有更大量的SL。最好是水培植物，因为根组织容易收获没有损失。高粱植物在水培培养中生长良好。
再次测量瓶的重量以估计用于SL提取的收集的根组织的重量。
添加内部标准（如果可用）。我们使用d 6 -5-deoxystrigol作为内标。内标的量应该是内源性5-脱氧蓖麻油的1/10至10倍，因此最好进行初步实验以估计内源SL的水平。通常，对于1g FW根样品加入500pg。将内标溶于乙腈或乙酸乙酯中，并加入到含有乙酸乙酯的瓶中。
用剪刀在乙酸乙酯中将根组织切成小块（约2-3mm长）。丙酮可用于萃取，但丙酮萃取物需要在LC-MS/MS分析前纯化。
保持瓶子在4°C至少2天。然而，长于一周的长期储存可能导致SL的逐渐劣化。
用含有滤纸的漏斗用根过滤溶液。然后，将溶液转移到分液漏斗中。加入10ml 0.2M K 2 HPO 4并混匀。用pH指示剂纸检查水相（下）的pH。如果水相仍然是酸性的，用10ml 0.2M K 2 HPO 4水溶液重复洗涤乙酸乙酯溶液。
在锥形瓶中收集乙酸乙酯溶液，并加入1-2g无水MgSO 4或Na 2 SO 4。
通过使用漏斗和滤纸将乙酸乙酯溶液转移到蒸发烧瓶（300ml）中，并在低于35℃的旋转蒸发器上真空浓缩。
将残余物溶于少量乙酸乙酯（总共约20ml）中，转移至较小的蒸发烧瓶（50ml）中并真空浓缩。
用100μl乙腈溶解残留物，并将样品溶液转移至离心柱。在3,000rpm离心30秒后，将滤液转移到用于LC-MS/MS的小瓶中。这些样品应保持在或低于4°C，直到使用。
进行LC-MS/MS分析（图1）。

图1.高粱根中独脚金内酯的LC-MS/MS分析。 sorgomol（顶部），5-脱氧芪醇（中间）和d 6 - 5-deoxystrigol（bottom）。
独脚金内酯的检测和定量的LC-MS/MS分析条件。独脚金内酯的分析使用具有电喷雾离子化（ESI）源并偶联至UHPLC系统的三重四极/线性离子阱仪器（LIT）进行。
在C18柱（φ2.1×150mm，2.6μm;）上通过使用含有0.1％（v/v）乙酸梯度的乙腈（MeCN）-H 2 O 2到柱上实现色谱分离，从35％MeCN开始，并在20.0分钟时升至95％MeCN。最后，使用该溶剂组合物将柱平衡3分钟。该柱在30℃下以0.2ml/min的流速操作。
使用LIT以产物离子扫描模式记录MS/MS光谱。离子源维持在400℃，窗帘气体为20psi，碰撞活化解离（CAD）气体为7psi（对于LIT为12psi），离子源气体为80psi，离子源气体2为70psi。离子溅射电压在正离子模式下设定为5500V，在负离子模式设定为-4500V。去簇，入口和碰撞单元出口电位分别维持在60,10和15V。将溶解在2μlMeCN中的1/5乙酸乙酯提取物样品注入LC-MS/MS。
监测sorgomol（保留时间6.49分钟）的m/z 347-231,347-233和347-97的跃迁; （保留时间12.02分钟）的m/z 331-234,331-216和331-97;在ESI正模式中（保留时间为11.94分钟）的d 6+ 5-脱氧立枯异丙酯（保留时间为11.94分钟）的m/z 337-240,337-222和337-97 em>等人，2015）。

食谱

0.2 M K sub 2 HPO 4
34.8g K 2 HPO 4
将dH <2> O添加至1,000 ml
存储在RT
乙腈与0.1％乙酸用于LC-MS/MS
加入500μl乙酸到500ml乙腈中超声处理几分钟
存储在RT
含有0.1％乙酸的水用于LC-MS/MS
向500 ml水中加入500μl乙酸
超声处理几分钟
存储在RT

笔记

SL的根含量随高粱植物的氮（N）和磷（P）状态而变化。在N或P缺乏下，大豆异黄酮和5-脱氧天竺葵的根含量约为200和300pg/g根FW。当植物经受足够的N和P时，这些值可以降低到1/100。由于高粱产生相对大量的SL，当在N或P缺乏下生长时，单株植物（苗）足以用于SL定量。为了使个体差异最小化，最好一式三份用5至10株植物进行实验。

致谢

该方案改编自以前公开的研究，Yoneyama等人（2013），Yoneyama等人（2015）和Xie等人。（2015）。 Kaori Yoneyama由JSPS青年科学家奖学金和JSPS Restart Postodoctoral Fellowship支持。

参考文献

Ueno，K.，Hanada，A.，Yamaguchi，S.and Asami，T。（2010）。制备用作定量LC/MS的内标的多氘化5-脱氧芪醇。/a> J。 Label Compd Radiopharm 53（13）：763-766。
Xie，X.，Yoneyama，K.，Kisugi，T.，Nomura，T.，Akiyama，K.，Asami，T.and Yoneyama，K.（2015）。独脚金内酯从根部转移到枝条，尽管不是通过木质部。 J Pestic Sc??i 40（4）：214-216
Xie，X.，Yoneyama，K.，Kusumoto，D.，Yamada，Y.，Takeuchi，Y.，Sugimoto，Y.and Yoneyama，K.（2008）。 Sorgomol，根部寄生植物的萌发刺激剂，由高粱产生。 Tetrahedron Lett 49：2066-2068。
Yoneyama K.，Kisugi T.，Xie X.，Arakawa R.，Ezawa T.，Nomura T.和Yoneyama K.（2015）。除了植物生长素以外，来源于射线的信号参与根系中独脚金内酯生产的系统调节。 241：687-698。
Yoneyama，K.，Xie，X.，Kisugi，T.，Nomura，T.and Yoneyama，K。（2013）。氮磷施肥会对高粱中的独脚金内酯生产和渗出产生负面影响。 238（5）：885-894。