材料和试剂

玻璃滑槽
盖玻片
48孔板
剃刀片
短旋转枝（SRC）柳树[栽培品种分辨率 - 系谱： viminalis。 x（ S。viminalis。 x S。schwerinii SW930812）] x [ viminalis。 x（ s。viminalis。 x S。schwerinii 'Quest'）]}
37％甲醛（36.5-38％，在H 2 O中）（Sigma-Aldrich，目录号：F8775）
乙酸（≥99.7％）（Sigma-Aldrich，目录号：320099）
乙醇
FAA：3.7％甲醛，5％乙酸和47.5％乙醇
Oasis ^?花卉泡沫（OASIS Floral Products）（ http://oasisfloralproducts.com/）
Safranin-O溶液（Sigma-Aldrich，目录号：HT90432）
用于组织学的DPX Mountant（Sigma-Aldrich，目录号：06522）
注意：本产品在Sigma-Aldrich公司名为"载玻片（对二甲苯 - 双（N-吡啶鎓溴化物））"。
蒸馏水
β-D-葡萄糖基Yariv试剂（Biosupplies Australia Pty Ltd.，目录号：100-2）
Histoclear清除剂（National Diagnostics，目录号：HS-200）
氯唑黑E /直接黑38（Sigma-Aldrich，目录号：C1144）

设备

Reichert滑动切片机
镊子（用于处理部分）
光学显微镜

程序

X射线μCT也可以潜在地用于更广泛的作物，以及更多样化的生物问题集。在大多数情况下，在扫描前应注意空气干燥材料;水饱和度将降低细胞壁对比度，而强制干燥超过纤维饱和点会带来诱导细胞萎缩的风险，从而改变植物的组织结构。图1和视频1中提供了植物研究技术更广泛潜力的一个例子

图1. Miscanthus 节间3D渲染。X/3D 3D计算层析成像 miscantus x giganteus
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视频1.杨柳X射线μCT扫描的3D渲染（品种分辨率）。 2厘米茎段（剥皮）。血管内腔。

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干抽样
使用3D X射线μCT扫描的研究评估木质部纤维PCD（Brereton等人，2015）使用短旋转杨树（SRC）柳树（栽培品种：分辨率谱系： x（
1. 收获从茎的中点6-8厘米的样品整茎段。
  注意：这是故意选择的，优先于传统的集合乳房高度为1.3米，以允许发育相当 ?分析不同形态的基因型。
2. 切两个小三角形切口插入木材3-4厘米沿线段使用a 剃刀刀片（确保通过树皮到达次要木质部），两个凹口应当位于与横向不对称的位置 ?透视（见图2）。
  
  图2.氯唑黑和番红 ?O染色。经典切片和光学显微镜染色可以 ?用于帮助导航和定向茎的组织结构（图A）。在这种情况下，氯唑黑E（抗褪色 safranin O）用于在a的张力木材中染色g-纤维的g-层 ?然后可以得到SRC柳树的尖端茎样品（品种分辨率） ?与来自μCT扫描的图像（图B）对准。注意，有整个3D茎的变化（纵向变化 ?在组织中以及横向），因此在茎中有多个缺口生物质被扫描（一个在这里可以看作一个单一的三角形切入面板A）是帮助导航3D体数据的重要工具扫描与组织的自然不对称一起。比例尺= 4 mm。
3. 将片段切成两半，以创建两个3-4厘米的片段。一个3-4厘米茎段（茎A）将用于X射线μCT扫描其他（茎B）将用于相关染色和光或共聚焦显微镜。凹口将有助于导航片段（允许重叠和对齐），并且可以在3DμCT渲染（茎A）或切片期间（茎B）在计算机中移除。
4. 至使切片，染色和X射线μCT扫描分化更简单，树皮可以在这一点从两个茎段手动除去剥皮或用手术刀
5. 收获后茎段应在FAA - 甲醛，乙酸，酒精溶液（3.7％甲醛，5％乙酸和47.5％乙醇）。
干燥和pre-μCT扫描准备
1. 在将茎A固定到> 3天，分段应该从FAA溶液中移出，并在3D前4天在H 2 O中简单洗涤 X射线μCT扫描。
2. 茎A的空气干燥应在室温（不大于30℃）下干燥4-5天以上环境空气流通相对较好。强制干燥较高温度可以从细胞壁吸出H 2 O 2（超过纤维饱和点）导致细胞壁塌陷。在非常干燥的气候（低湿度），这也可以在空气干燥期间发生。
  注意：风干的茎样本似乎是在创造对比之间的必要步骤 ?生物系统中的三个要素正在仔细检查：细胞壁，原生质体和空隙空间。空气干燥的重要因素样品是"全"细胞，管状形状，容易区别于胞内空隙空间（这不是这种情况 ?"湿"，因为胞内空隙空间充满水（图3）。
  
  图3.湿和空气干燥生物量2D计算层析成像扫描 3D X-RayμCT模型是从> 1,000张2D图片中渲染，例如来自SRC柳树（栽培品种）的倾斜茎样品的那些分辨率）。 A表示扫描的样本的2D切片 "湿"，而B表示在具有之后相同样品的2D切片空气干燥3-4天。细胞壁，细胞之间的对比度更大与原生质体（尚未完成程序性细胞死亡）和空白体积在空气干燥的样品中可见
3. 一旦茎A 空气干燥的样品通常可以固定在低密度介质中标准Oasis ^?花卉泡沫（酚醛基聚合物，应小心如果具体研究纤维素，因为这样低的密度是硬的 ?以区分）并且被定位用于具有一个或多个结构的扫描兴趣在扫描体积的中心。
渗透
1. 随着X射线吸收随a中的原子数的增加而增加体素，茎样品可能被真空渗透重金属前3D X射线μCT扫描。如用磷钨酸（Staedler等人，2013）。
后μCT扫描
1. 一旦茎A 已经被扫描（Brereton等人，2015）破坏性密度可以进行测量。基本密度（Biermann，1996; Jourez等人， 2001）最适合于生物质密度定量并入组织结构变异通常有意义生理学
2. 绿色之前，真空渗透茎A与水体积通过水置换测量（Biermann，1996）。真空可以通过在浸没木材上抽真空来进行渗透样品约24小时，取决于所使用的材料。木烤箱干燥然后在105℃下干燥过夜后测量重量
3. 计算为（Biermann，1996; Jourez等人，2001）：基本密度=烘干质量/体积。
切片和染色
来自茎B的横截面的染色允许不同的组织类型在茎内可视化和定量。清楚 ?跟随每个茎段和导航自然不对称（以及作为凹口切入茎），in silico 3D X射线μCT渲染， g-纤维的g-层[chlorazol black E（Brereton等人，2015; Brereton等人，2011; Brereton等人， >，2012; Robards and Purvis，1964）]， β-半乳糖基Yariv试剂（Tryfona等人，2012; Kitazawa等人， 2013），继发性细胞壁（safranin O）和细胞内容物的残留物（考马斯和β-半乳糖基Yariv）可以比对并原位比较。原位β-半乳糖基Yariv试剂和考马斯染色似乎是 ?没有公布的优先顺序，但简单有效。考马斯染色对于宏观导航（在整个过程中）特别有效横断面）的细胞内容物残留使用光学显微镜，as 经典的活力染色在木质组织中是无效的（例如作为：隧道和NBT）由于在切片期间的细胞破坏处理。染色时间和浓度只是建议因为细胞壁结构将取决于所研究的植物和生长条件。
1. 一旦茎B固定在Reichert雪橇上切片机，将刀片角度调整到正确的平面（这可能需要一些试验和错误取决于材料），用样品缓冲水切割， 30μm。
2. 48孔板对于在同一组部分上同时进行多个染色管道是有用的
3. 使用镊子在整个过程中，首先在H 2 O中放置一段以水合 2分钟，然后使用切片进行氯唑黑E染色， β-半乳糖基Yarive试剂原位染色或考马斯原位染色（细胞壁抗体也可以与分析这里）。
Chlorazol black E染色（示例图2）
1. 通过将切片置于含有1％番红O（aq）的孔中2-3分钟进行逆染色。
2. 在含有H 2 O x2的孔中洗涤30秒。
3. 放置部分进行脱水系列：50％乙醇30秒，75％乙醇30秒，100％乙醇x2 1分钟。
4. 将部分置于含有1％氯唑黑E（在甲氧基乙醇中）的孔中4分钟以染色g层。
5. 在含有100％乙醇x2的孔中洗涤1分钟。
β-半乳糖基Yariv试剂染色（示例图4）
1. 将切片置于0.1mg/ml稀释的β-半乳糖基Yariv试剂中，0.15 ?并在室温下温和摇动孵育4小时平台。
2. 根据需要在含有H 2 O的孔中洗涤
3. 转到步骤E9。
  
  图4.原位β-半乳糖基Yariv试剂染色。β-半乳糖基 Yariv试剂长期以来被用于冷凝阿拉伯半乳聚糖蛋白（AGP）。由于张力木材中的g-纤维的g-层富含 Fasciclin样阿拉伯半乳聚糖蛋白（Lafarguette等人，2004; Andersson-Gunneras等人，2006），β-半乳糖基Yariv试剂很好地起作用作为SRC柳树茎的紧张木材中的g层的原位染色剂以及作为原生质体染色（活细胞也将包括AGP）。光 SRC柳树尖端茎样品的显微镜检查（品种分辨率）显示了紧张的木材g层和延迟的PCD的图案化对齐图2的相同样品使用光放大显微镜到x63说明：B.张力木（TW），C对立木（OW）和D TW/OW界面显示了原位β-半乳糖基Yariv ?试剂染色可以区分这些细胞组分。比例尺 ?= 4 mm。
考马斯染色（示例图5）
1. 将切片置于1％考马斯溶液中，在室温下在轻轻摇动的平台上孵育4小时
2. 根据需要在含有H 2 O的孔中洗涤
3. 转到步骤E9。
幻灯片构造
1. 冲洗染色部分在Histoclear清除剂1分钟。在此阶段应用DPX滑动到稍微设置（1分钟左右）
2. 将部分放在DPX上，并应用盖玻片，轻轻下降。应用 ?压力迫使气泡，放一些重量（几克）顶部并设置为24小时。
  
  图5.原位考马斯染色 A.用1％考马斯染色的缝合的25μm横切片溶液并用番红O染色。B.缝合25μm 横截面无复染，细胞内含物残留可见（如果存在）。虽然z堆叠图像难以组装清楚地使用考马斯染色，该过程是无价的评估使用光学显微镜检查细胞含量的残留（通过眼睛，作为一个可以移动 ?轻微通过3D空间使用光学显微镜）和导致使用3D X射线μCT鉴定相同的PCD图案。比例尺= ?4mm。

致谢

作者在加拿大生物燃料网的资助下。 X射线μCT扫描与Farah Ahmed和Dan Sykes在自然历史博物馆合作进行，由BBSRC可持续生物能源中心（BSBEC）资助，在BSBEC BioMASS（ http://www.bsbec-biomass.org.uk/）计划。原位染色技术是与Michael Jasmine Ray博士合作开发的。

参考文献

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