材料和试剂

1ml胰岛素注射器（Thermo Fisher Scientific，BD，目录号：22-253-260）
精密滑动针（30G×1/2）（BD，目录号：305106）
用于肌电图的一次性单极针电极（Rochester Electro Medical，目录号：016386-0）
盐酸氯胺酮
1. Ketaset（氯胺酮注射液）（药品，目录号：NDC-0856-2013-01）
2. Henry Schein（100mg/ml溶液）（NSN，目录号：304401）
甲苯噻嗪盐酸盐（镇静和止痛溶液）（20mg/ml溶液）（LLOYD，AnaSed INJECTION，目录号：139-236）
无菌双蒸水
紫环酮碘5％（Betadine）防腐剂 - 杀微生物剂溶液（购自任何药店）
地塞米松眼用软膏（TobraDex）（Alcon）
70％乙醇（表面消毒剂）
盐酸氯胺酮和盐酸赛拉嗪的混合物（参见配方）

设备

用于肌电图的一次性单极针电极（Rochester Electro Medical，目录号：016386-0）
安装了BioSig32 Windows应用程序的计算机
TDT BioSigIII系统（TDT）
TD扬声器（TDT）
隔音室（工业声学公司，受控声学环境）
非电加热垫（在测试期间保持动物体温）（Braintree Scientific，Deltaphase Isothermal Pad，型号：39DP）
CONAIR潮湿电热垫（在恢复期间保持动物体温）（亚马逊）
用于体温监测的直肠探头（Physitemp Instruments，型号：Thermalert TH-5 physitemp）
清洁空笼子
镊子风格5（Ted Pella，目录号：5665）

软件

BioSig32软件（随TDT BioSig III系统提供）

程序

本协议中描述的所有程序和动物处理应根据批准的国家伦理指南进行，并遵守机构动物护理和使用委员会的所有协议要求。
注意：

执行以下程序需要适当的站点特定IACUC批准。
小鼠听力开始在出生后第12天（P12），因此可以对P12以上的小鼠进行听力测试。
在该方案中使用FVB小鼠品系，但是任何小鼠品系可以与该方案一起使用。

准备
1. 将动物用腹膜内麻醉注射盐酸氯胺酮（Ketaset 100 mg/kg）和 ?甲苯噻嗪盐酸盐（Xyla-Ject 10mg/kg）注射器与精确滑翔针。
  注意：
  1. 在使用鼠标时，应随时佩戴手套和实验室外套。
  2. 此外，对于经验不足的用户，注射较老的老鼠以防止咬伤时，可能会穿着重的手套。
  3. 建议仅使用氯胺酮和赛拉嗪溶液麻醉时测试听力因为这种药物组合提供稳定ABR阈值。
2. 注射后将动物放入 ?隔离清洁和温暖的笼子（?37°C）使用电加热垫或其他听力设备注意：没有其他清醒的动物应该使用麻醉的鼠标。
3. 鼠标将准备在?2-5分钟内进行测试。适当可以用诸如脚趾捏的刺激来测试麻醉水平。
4. 将鼠标放在预热的非电加热垫（?37°C）在隔音室。
5. 在整个记录过程中用直肠探头监测体温。
6. 用保护性眼用软膏覆盖动物的眼睛在麻醉期间保持眼睛湿润。这也将压制动物的眨眼反射，这会增加记录的噪音。
7. 放置鼠标，使扬声器放在离左耳10厘米处。
  注意：
  1. 此设置的扬声器使用ACO Pacific 7017麦克风进行校准。
  2. 扬声器的中心必须与外耳道对齐。
    对于听力阈值评价，使用3个皮下电极：接地，参考和有源电极，放置在下面2-3mm 皮肤的鼠标头（图1-2）。
8. 将活性电极以皮下方式插入前额（图1和图2：红色）。
  注意：使用干净的镊子抬起和拉紧皮肤。
9. 将参考电极插入左耳耳廓下方（图1和图2：蓝色），和接地电极下面对侧（右）耳（图1和图2：绿色）。
  注意：图1显示了鼠标在所有3的记录位置的图片 ?放置在隔音室内的头上的电极和图2 显示电极的确切位置。
  
  图1.鼠标 ABR录音的位置。鼠标位于距离扬声器10厘米处在加热垫上，所有3个电极放置在头部，内隔音室
  
  图2. 3个电极的位置鼠标头。蓝色，绿色和红色箭头代表确切的电极在鼠标头中的位置。蓝色的图片电极。 "F"表示前额，"R"表示右耳和 "L"表示左耳。
10. 检查阻抗：如果阻抗是超过5欧姆，调整电极在头皮和重新拍摄测量。继续操作电极，直到阻抗低于5欧姆。
11. 关闭隔音室。
12. 声音 ?并且在自由场条件下记录ABR （Akil等人，2015; Akil等人，2012; Akil等人，2011）中所描述的， ?2006）。
  注意：单独测量每只耳朵，而不是声音自由场ABR，具有耳塞的管可以从扬声器运行到耳道直接（近场），以上过程重复。
记录点击听觉脑干反应
TDT软件（BioSig III）和硬件（RP和TD扬声器）用于ABR记录
1. TDT BioSigIII系统，产生并记录20毫秒的刺激持续时间和31Hz。对于点击刺激，其中提供了鼠标具有在90dB之间的降低水平的宽频谱点击（0.1ms）和10 dB，每个新的刺激被记录下来5 dB SPL 以前。记录每个测量点并平均510次
  注意：
  1. ABR结果可能受到其他影响电子设备在隔音室 - 关闭外部传输电子设备在室内，并确保加热垫下的鼠标是非电的。
  2. 动物温度 - ?在整个记录期间用直肠探针监测体温并使用加热垫保持鼠标的体温温暖（Gold et al。，1985）。
2. 继续记录ABR，直到波形明显不再存在。
  注意：
  1. 如果中耳，耳蜗或脑干不能正常工作， ?波形将不被记录（图3示出了ABR的样本来自野生型（正常）和聋鼠的波形）。
  2. 中位数野生型小鼠中的ABR阈值可以根据系统（TDT或 ?哈佛装置）和用于收集的方法（关闭或自由场） ?它。通常，ABR阈值为?30±5dB SPL。
    
    图3。来自野生型和聋小鼠的代表性ABR示踪。野生型小鼠 ?呈现正常ABR波形，而聋小鼠呈现没有可识别的ABR反应。 "I-V"指示ABR峰的位置。 ?黑色箭头表示ABR阈值（33dB SPL）。
3. 读取结果并确定ABR阈值，或可以看到可识别波形的最低级别。
  1. 阈值可以通过观察前5个峰来确定。
  2. 应在前10毫秒内看到所有五个峰。
  3. ABR阈值被确定为最低可识别ABR反应（图3：黑色箭头）。
4. 保存结果波形以供将来参考和分析。
记录特定频率的听觉脑干反应
1. 当记录频率特定ABR时，三个频率经典测试以检查耳蜗的区域的程度 ?（对应于基地，中转和顶点），虽然在中任何特定频率的原理都可以测量。色调爆发刺激3 ?单个频率（1ms），包括8kHz，16kHz和32kHz 以90 dB和10 dB之间的递减电平呈现。每个新刺激被记录为从以前的演示下来的5dB SPL。每测量点被记录并平均1000次并分析
2. ABR阈值被确定为类似于上述描述的最低可识别ABR响应
3. 保存结果波形以供将来参考和分析。
  注意：
  1. 一般来说，在第一次麻醉剂注射后约30-40分钟，小鼠将保持麻醉状态。
  2. 由于点击和频率特定ABR记录的持续时间（约40分钟），麻醉剂原始剂量的五分之一应该在约20分钟注射以避免小鼠醒来的可能性 ?在测试期间。
  3. 如果鼠标开始移动，ABR录音 ?将被破坏，鼠标必须重新麻醉五分之一的原始麻醉剂量。
4. 完成录制后，小心地从鼠标中取出电极。
5. 当所有测试完成后，将电极浸入聚维酮碘溶液约1小时;然后用70％乙醇冲洗 ?盖上它们并将它们放置在无菌容器中。
6. 用70％乙醇清洁记录室和所有与小鼠接触的表面
从麻醉中恢复
1. 将鼠标放在一个空的和清洁的预热笼中从麻醉中出现。不要让老鼠无人看管，直到他们完全恢复。将这个笼子放在加热垫上保持小鼠的体温直到从麻醉中恢复完全发生。
  注意：同一组的多只小鼠可以放置在同一笼中（不超过5只小鼠）。
2. 返回小鼠到他们原来的笼子，没有加热垫，如果他们可以放在他们的背后自己回到自己的脚。

代表数据

图4. ABR测试的代表图。在具有正常ABR（黑色，蓝色和绿色曲线）和异常ABR（红色曲线）的小鼠中测量ABR阈值（声压级的分贝，dBSPL）。与具有正常ABR的小鼠相比，具有异常ABR的小鼠在点击刺激和色调刺激（8,16和32kHz）下显示更高的ABR阈值。

食谱

盐酸氯胺酮和盐酸赛拉嗪的混合物
它含有氯胺酮盐酸盐（Ketaset 100 mg/kg）和盐酸赛拉嗪（Xyla-Ject 10 mg/kg）：
2ml氯胺酮（100mg/ml） 1ml甲苯噻嗪（20mg/ml） 5ml无菌双蒸水
混合均匀，放在橡胶密封的小瓶中注意：

可以使用氯胺酮和赛拉嗪的溶液，只要氯胺酮或赛拉嗪不过期并且是无菌的。

溶液在不使用时应保存在4℃，在使用时保存在室温下。

致谢

作者要感谢听力研究公司（HRI）和NIH（NIDCD）Grant＃R01DC0130671提供的资金支持。

参考文献

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Akil，O.，Seal，R.P.，Burke，K.，Wang，C.，Alemi，A.，During，M.，Edwards，R.H。和Lustig，L.R。（2012）。使用病毒介导的基因治疗恢复VGLUT3敲除小鼠的听力。 Neuron 75（2）：283-293。
Akil，O.，Sun，Y.，Vijayakumar，S.，Zhang，W.，Ku，T.，Lee，C.K.，Jones，S.，Grabowski，G.A。和Lustig，螺旋神经节变性和听力丧失是鞘脂激活素B缺陷小鼠卫星细胞死亡的结果。/a> J Neurosci 35（7）：3263-3275。
Burkard，R.F.，Eggermont，J.J.and Manuel，D。（eds）。（2007）。听觉诱发电位：基本原理和临床应用。 < em> Lippincott Williams&威尔金斯，费城。
Gold，S.，Cahani，M.，Sohmer，H.，Horowitz，M。和Shahar，A。（1985）。体温升高对大鼠听觉神经 - 脑干诱发反应和脑电图的影响。 a> Electroencephalogr Clin Neurophysiol 60（2）：146-153。
Zhou，X.，Jen，P.H.，Seburn，K.L.，Frankel，W.N.and Zheng，Q.Y。（2006）。 10个近交系小鼠的听觉脑干反应 em> 1091（1）：16-26。