材料和试剂

无菌一次性移液管（10ml和5ml）
铝箔
四孔组织培养板（Thermo Fisher Scientific，Nunc ^{TM，目录号：176740）}
圆形玻璃盖玻片（12mm）（Bellco Glass，目录号：1943-10012A）
parafilm
HM1：IMSS毒株（来自印度新德里Jawaharlal Nehru大学生命科学学院Alok Bhattacharya教授的赠品）
荧光标记的纤连蛋白（CYTOSKELETON，目录号：FNR02）
戊二醛（dH 2 O中25％储备液，EM级）（Sigma-Aldrich，目录号：G5882）
硼氢化钠（NaBH 4）（Sigma-Aldrich，目录号：452882）
聚-L-赖氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：P8920）
70％乙醇（Merck Millipore Corporation）
Alexa 568鬼笔环肽（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ，目录号：A12380）
1％BSA（Sigma-Aldrich，目录号：A-7906）的PBS
Mowiol封固剂（Sigma-Aldrich，目录号：81381）
完全BI培养基（不完全补充15％，成人牛血清）
GasPak ^TM EZ Anaerobe Pouch System（BD Biosciences，目录号：260683）
无菌dH 2 O 2/b
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
KCl
磷酸二氢钾（Na 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P5655）
磷酸氢二钾三水合物（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P5504）
NaOH
Hilyte 488纤连蛋白
生物蛋白胨BBL（BD Biosciences，目录号：211862）
葡萄糖（葡萄糖）（Sigma-Aldrich，目录号：D9434）
L-半胱氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：C1276）
L-抗坏血酸（Sigma-Aldrich，目录号：A5960）
柠檬酸铁铵（Sigma-Aldrich，目录号：F5879）
10x磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见配方）
0.01％聚-L-赖氨酸溶液（见配方）
0.5％戊二醛溶液（见配方）
5mg/ml硼氢化钠（参见配方）
4％多聚甲醛（PFA）（参见配方）
1％BSA的PBS溶液（见配方）
0.1％Triton-X-100（参见配方）
100μg/ml Hilyte488纤连蛋白（FNR02）（见Recipes）
基本不完全培养基（见配方）
完整介质（见配方）

设备

层流气流罩
37℃孵育器
镊子
湿室
真空泵和带管道的玻璃巴斯德移液器
台式离心机，带有旋转叶片转子

程序

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视频1. 体外荧光基质降解试验阿米巴溶组织

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用荧光基质涂覆玻璃盖玻片

用丙酮清洁玻璃盖玻片，风干，使用前通过高压灭菌消毒。
此外，在无菌条件下处理盖玻片层流气流罩。将盖玻片转移到四井组织培养板使用乙醇擦拭镊子
每个盖玻片用0.01％聚-L-赖氨酸，使用80μl聚-L-赖氨酸溶液盖玻片在室温下20分钟。空气干燥下的溶液 ?罩
通过加入500μl的无菌1x PBS洗涤盖玻片轻轻地到孔的侧面并孵育5分钟。的聚-L-赖氨酸涂层的侧面应当在洗涤期间面向上。之后每个使用无菌玻璃巴斯德吸管轻轻吸取它到真空泵并重复洗涤三次
之后 ?第三次PBS洗涤，向每孔中加入500μl冰冷的0.5％戊二醛 ?使得盖玻片浸没并在室温下在黑暗下孵育温度15分钟
吸出戊二醛溶液轻轻地倾斜板的角度，使盖玻片不干扰并再次用无菌1x PBS洗涤。重复洗涤三次。
使用薄纸和70％乙醇。整齐地做一叠纸巾通过折叠和通过喷洒70％乙醇来润湿。将堆放在无菌的 petridish做一个潮湿的房间。把一个整齐切割的石蜡膜放在湿纸巾叠，轻轻按压，使其粘贴良好
现在，放置适当数量的50微升预热（37°C，优选在水浴中）荧光标记的纤连蛋白（100μg/ml）根据涂布的盖玻片的数量在石蜡膜上
小心地从保持在边缘的井提起盖玻片使用一对镊子并将它们与聚-L-赖氨酸涂层侧面向下在荧光纤连蛋白的滴上石蜡膜。放置盖玻片时，确保没有空气气泡陷在他们下面。如果是这样，轻轻地按盖玻片 ?镊子，以消除被困的气泡
在37°C孵育箱中在安全光照下孵育1小时
一小时后，从培养箱中取出盖玻片。现在盖玻片应在安全光线下处理。提起盖玻片仔细一个一个地用镊子的帮助不刮伤 ?基质，并将它们的涂层面朝上放在新鲜组织培养板
再次用1x PBS轻轻地洗它们 ?同时，制备新鲜的5mg/ml的溶液硼氢化钠溶解在1×PBS中。加入500μl钠硼氢化物，使得盖玻片浸入其中。在黑暗中室温孵育15分钟。作为钠硼氢化物气泡在溶解时确保气泡不会通过轻轻地来回摇摆来安置在盖玻片上
用1x PBS洗涤盖玻片三次，然后终于通过将其在室温下浸泡在70％乙醇中10分钟来灭菌温度。进一步用无菌1×PBS洗涤盖玻片，然后最后向每个孔中加入500μl完全BI培养基并在37℃下孵育 ?℃的培养箱中培养1小时
盖玻片现在准备好了用过的。如果你不想使用它们立即消毒他们使用 70％乙醇，然后将其在4℃下在黑暗中储存长达一周。

取合并的溶组织内阿米巴HM1：IMSS菌株对数相并除去使用的介质。加入10毫升新鲜完全BI培养基，并将玻璃管在冰上转移5分钟 ?分离细胞。玻璃管中的培养体积为13ml
现在轻轻点击管，以完全分离滋养体和转移到15ml锥形管中。取一小部分计数使用血细胞计数器。将它们以500 x g 旋转5秒 min。现在重新悬浮细胞沉淀在温暖的完成 BI培养基中至浓度为40×10 4个细胞/ml
加入0.5ml 细胞，即每孔超过荧光基质包被的2×10 5个细胞盖玻片，并将组织培养板放置在GasPak EZ袋内以维持厌氧条件。将整个设置在37°C 孵化器。
在37℃，黑暗下孵育36-48小时
在接近培养结束时，在37℃下加热1×PBS和4％PFA的等分试样以备进一步使用。

准备样品用于荧光显微镜

通过将板倾斜到一个角度而不干扰，吸出介质盖玻片。现在用温热的无菌1x PBS洗涤细胞，并修复细胞立即使用4％PFA。在室温下孵育15分钟暗处。
固定后，用1x PBS洗涤样品用0.1％Triton-X-100在室温下透化10分钟。洗 ?再次在室温下用含有1％BSA的PBS封闭样品1小时温度
为了用Alexa 568鬼笔环素标记，在封闭溶液（PBS中的1％BSA）中以1:100的比例稀释鬼笔环肽。
将盖玻片小心地转移到潮湿的房间，并再次添加 50μl的Alexa 568鬼笔环肽到每个盖玻片，并在黑暗中孵育在室温下搅拌1小时
随后，通过将样品再次放回组织培养板并加入1×PBS来洗涤样品
最后一次洗涤后，使用固定介质安装样品。让样品在室温下在黑暗下风干
使用检查基质和样品的荧光落射荧光或共聚焦显微镜与适当的光源和 ?过滤器集。因为所形成的基质层非常薄应该准确地聚焦，以便整个视场都有均匀荧光。可以观察到基质的降解细胞周围的荧光丧失，并且将表现为暗晕围绕细胞。

图1。 A.滋养体过表达 Rab21CA突变体涂布在Hilyte 488纤连蛋白包被的玻璃上盖玻片并在37℃在黑暗下孵育48小时。细胞被固定，渗透并用Alexa 568鬼笔环肽和DAPI染色。 B.未受损的Hilyte 488纤连蛋白。比例尺， ?10μm

笔记

总是准备新鲜的0.5％戊二醛溶液。由于此溶液有危险，请避免接触皮肤和眼睛。
硼氢化钠也应该在使用前准备好。溶解后，硼氢化钠释放游离的H 2气体，因此其应当总是在具有足够自由空间的锥形管中制备以避免溶液的溢出和碰撞。不要紧紧盖住装有溶液的试管
定期传代细胞，不允许细胞生长至100％融合。使用70-80％汇合的细胞用于实验

食谱

10x磷酸盐缓冲盐水（PBS）
将80g NaCl溶于2g KCl，14.4g Na 2 HPO 4，2.4g KH 2 PO 4溶液，
用NaOH调节pH至7.4 将dH <2> O添加至1,000 ml
过滤灭菌（0.2μm）
在室温下贮存
0.01％聚-L-赖氨酸溶液在无菌的dH 2 O中以1:10的比例稀释0.1％的聚-L-赖氨酸溶液
0.5％戊二醛溶液
将0.2ml储备溶液加入10ml无菌1x PBS中
5mg/ml硼氢化钠
称量100mg硼氢化钠
在使用前溶于20 ml 1×PBS中
4％PFA
称量4g PFA
在恒定搅拌下溶于100ml预热的1×PBS中
1％BSA的PBS溶液中称取0.5g BSA，并溶解于50ml 1x PBS中
0.1％Triton-X-100 制备10％Triton-X-100在1x PBS中的储备溶液
加入0.5ml的10％Triton-X-100在50ml的1x PBS中
100μg/ml Hilyte488纤连蛋白（FNR02） Hilyte 488纤连蛋白作为干燥粉末，并在4℃下在黑暗下储存。使用无菌dH 2 O 2/d溶解粉末至终浓度为1mg/ml。将等分试样并保存在-20°C
基本不完全培养基
溶解：
3克生物蛋白胨BBL 1g葡萄糖
200 mg NaCl
60mg的KH 2 PO 4 sub/
100mg的K 2 HPO 4
100mg L-半胱氨酸 20mg L-抗坏血酸和2.28mg在dH 2 O中的柠檬酸铁铵
用8N NaOH将pH调节至6.8 将dH <2> O添加至88ml
在121℃，15psi下高压灭菌15分钟
完成媒介
将15ml成年牛血清（过滤灭菌）和2ml 100×维生素混合物（过滤除菌）加入88ml基础不完全培养基中

致谢

我们要感谢Alok Bhattacharya教授（印度新德里的Jawaharlal Nehru大学）和Sandipan Ganguly博士（印度加尔各答的霍乱和肠道疾病国家研究所），为我们提供了溶组织内阿米巴> HM1：IMSS菌株。我们感谢Stefan Linder教授（德国汉堡大学）提供有益的讨论和建议。我们也感谢博士。 Vira V.Artym，Kenneth M.Yamada和Susette C.Mueller作为（ histolytica ）的方案已经改编自他们在Methods in Molecular Biology中研究癌细胞侵袭的已公布的方案。我们真诚地感谢Lekha Vinod Shah女士，最后一年是生物科学部IIShop博帕尔的双重BS-MS学位课程学生，他负责拍摄和编辑协议的视频。我们感谢印度的IISER Bhopal的中央仪器设施。这项工作由来自IISERB的内部资金和德国马克斯普朗克协会（MPG）和印度科学技术部（DST）的资金资助。 ME由印度政府大学奖学金委员会提供的高级研究奖学金资助。

参考文献

Artym，V.V.，Yamada，K.M.and Mueller，S.C。（2009）。用于分析局部细胞侵袭的ECM降解测定法 em。522：211-219。
Emmanuel，M.，Nakano，Y. S.，Nozaki，T。和Datta，S。（2015）。小GTP酶Rab21介导纤维连接蛋白诱导的肌动蛋白重组在溶组织内阿米巴中：：病原体侵袭。 PLoS Pathog 11（3）：e1004666。