材料和试剂

印刷纸
玻璃载玻片和盖玻片
试管
1 ^st，2 ^nd和3 ^rd叶进行有丝分裂研究
注意：年轻的叶子可以从幼苗和成熟的植物收获。
减数分裂研究的7和8阶段的花芽
注意：根据花蕾的长度分配。
饱和的对二氯苯溶液（Sigma-Aldrich，目录号：D56829）
注意：在Sigma-Aldrich网站上也将其命名为"1,4-二氯苯"。
冰醋酸（SRL，目录号：85801）
盐酸（HCl）
Orcein（Sigma-Aldrich，目录号：O7380）
胭脂红（Sigma-Aldrich，目录号：C1022）
无水乙醇（99％）（Merck Millipore Corporation，目录号：100983）
2％w/v乙酰乳酸凝胶（见配方）
1％w/v胭脂红染色剂（见配方）

设备

复合显微镜（ZEISS，型号：Primo-star）
冰箱（具有零度以下的冷冻室的家用冰箱）

程序

有丝分裂中期染色体研究（视频1）

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视频1.有丝分裂和减数分裂中期染色体的MS-制备

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1. 在9-10AM收集来自生长在实验花园中的健康植物的选择的幼叶（图1A）用于预处理
2. 只有年轻叶的顶端区域被切割（图1B）并保持在含有冷饱和溶液的样品管中对 - 二氯苯在0℃下5分钟（在正常的冷冻室中） ?家用冰箱），然后在10-12℃下预处理6小时（in 正常家用冰箱的冷冻室）。
3. 然后用蒸馏水彻底洗涤预处理的叶尖并在乙酸：乙醇混合物（1:3）中在室温下固定过夜温度
4. 将叶尖转移到45％乙酸中15分钟 ?然后用蒸馏水洗涤，随后用5水解 ?N HCl在冰箱中20分钟
5. 叶提示了用蒸馏水彻底洗涤，然后浸入45％乙酸中酸处理5分钟，然后用2％乙酰辅酶素染色过夜。
6. 然后将叶尖压扁并安装在45％乙酸中（将盖玻片放在叶尖上并用拇指施加渐进压力 ?以展开细胞）并在显微镜下观察
7. 显微照片用Zeiss primo-star显微镜（任何可以使用具有40x或100x物镜与油的复合显微镜浸没）和适当放大（图1C-E）
  
  图1。 A-B。在Coccinia grandis中有丝分裂染色体研究的组织样品; A. 1 ^st， ?选择2个和3个叶片用于预处理; B.只有顶端选择幼叶的区域，并且基底区域抛弃C.有丝分裂中期雄性植物; D.雌性植物; E. 雌雄同株植物。比例尺=5μm
减数分裂中期染色体研究
1. 第七和第八发育阶段的花芽（图2A-B）在4月至5月的11-11：30 AM直接从田间收集
2. 从选定的花芽除去萼片和花瓣，将花药保持在45％乙酸中5分钟。
3. 将一部分融合的花药涂抹在一滴2％的胭脂红染色剂中。
4. 10分钟后，将制备的载玻片通过火焰稍微温热
5. 30分钟后，将染色的细胞通过滴加45％乙酸在盖玻片的一侧上并通过拉动通路借助于条带从盖玻璃的相对侧流体 ?的吸墨纸;这一步是清除细胞质的关键被弄脏的花粉母细胞的背景。
6. 最后，将制备的载玻片包裹在吸墨纸的折叠中以除去通道的45％乙酸，在载玻片之间仅留下流体的薄膜和盖滑。
7. 显微照片用Leica显微镜拍摄并适当放大（图2C-D）。
  
  图2. A。减数分裂的 Coccinia grandis 的雄花蕾阶段 ?制备; B.雌雄同株雌花。减数分裂中期染色体（箭头指示X的端对端配对和Y染色体。 D.雌雄同株植物。比例尺= 1厘米的A和 B，对于C和D为5μm，

笔记

材料应在明亮晴朗的日子收集，以确保适当的有丝分裂期发展。阴天或阴雨天应避免材料收集。

食谱

2％w/v乙酰乳酸凝胶染色将奶粉加入沸腾的45％冰醋酸中，迅速冷却，然后使用任何实验室级滤纸过滤到深色玻璃瓶中。
1％w/v丙酮红染料
将胭脂红粉末加入沸腾的45％冰醋酸中，快速冷却，然后使用任何实验室级滤纸过滤到深色玻璃瓶中。

致谢

生物技术部（DBT），政府的财政支持。的承认。还承认来自IISER Pune的核心支持。

参考文献

Bhowmick，B.K.，Jha，T.B.and Jha，S。（2012）。异种葫芦中的染色体分析 Coccinia grandis （L.）Voigt。染色体科学 15：9-15
Ghadge，A.G.，Karmakar，K.，Devani，R.S。，Banerjee，J.，Mohanasundaram，B.，Sinha，R.K.，Sinha，S.and Banerjee，A.K。 Coccinia grandis的三种性表型的花发育，花粉生育力和性表达分析。 BMC Plant Biol 14：325。
Kumar，L.S。和Vishveshwaraiah，S。（1952）。 Coccinia indica中的性机制 wight and arn。 < em> Nature 170（4321）：330-331。
Roy，R.P.and Roy，P.M。（1971）。 Cocciniaindica的性别决定机制。 J Indian Bot Soc 50A：391-400。
Sousa，A.，Fuchs，J.and Renner，S.S。（2013）。 Coccinia grandis的分子细胞遗传学（FISH，GISH）：在开花植物中具有最大Y /常染色体分歧的3个月龄的葫芦科植物。 Cytogenet Genome Res 139（2）：107-118。