图1.人naEFC的富集。 A。通过光学显微镜比较在培养4天时的脐带血衍生的CD133 +富集的细胞（naEFC）和人脐静脉内皮细胞（EC）的细胞大小。比例尺=200μmB.通过使用流式细胞术分析的前向散射和侧向散射分析来评估细胞的富集过程的异质性（0-10天），并与成熟ECs比较。

图2.人naEFC的表面表达表型。通过流式细胞术评估在培养4天时的CD133 +富集的细胞的祖细胞和内皮标记物。直方图显示来自≥3个生物复制品的代表性实验，其中灰色虚线代表同种型对照，实黑色线代表用所示标记染色的细胞。 B.通过流式细胞术评价naEFC的功能，并与成熟EC相比，检测细胞吸收DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白（Ac-LDL）和结合FITC标记的Ulex europaeus凝集素的能力I（UEA-1）凝集素。密度图代表来自≥3个生物学重复的一个代表性实验的染色细胞。

材料和试剂

对于手动细胞分选
MS柱（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-201）
MacoPharma脐带血收集袋（MacoPharma，目录号：MSC1201DU）
50ml管（Corning，Falcon ，目录号：352070）
10ml管（Sarstedt AG，目录号：62.9924.284）
2ml软无菌球转移移液管，无菌（Stephen Gould corporation，目录号：222-1S）
注意：目前，它是"Capitol Scientific，目录号：222-1S"。
20μm滤器（Sartorius Stedim Biotec，Minisart，目录号：16534-K）
24孔板（Corning，Falcon ，目录号：353047）
微透镜管
20ml注射器
0.2μm过滤器
人脐带血（40-250 ml）
20x Dulbecco's磷酸盐缓冲（DPBS）（Life Technologies，Gibco ，目录号：14200-075）
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：14200-075"
无菌水（Baxter，目录号：UKF7114）
Lymphoprep ^TM（Axis-Shield，目录号：114547）
CD133微珠，包括人FcR阻断试剂（Miltenyi Biotec，目录号：130-050-801）
AutoMACS Pro洗涤溶液（Miltenyi Biotec，目录号：130-092-987）
AutoMACS运行缓冲液（Miltenyi Biotec，目录号：130-091-221）注意：如果AutoMACS Pro分离器不可用，可以通过手动排序分离感兴趣的细胞（见下文）。然而，这种手动方法不一定是最佳的naEFC细胞分选与较低的细胞活力和数量观察;因此优选AutoMACS方法。
使用Bullet试剂盒（EGM-2）（Lonza，目录号：cc-3162）的内皮生长培养基
胎牛血清，表征（FBS）（VWR International，Hyclone ，目录号：SH30071.03）
重组人血管内皮生长因子（VEGF）（Sigma-Aldrich，目录号：V7259）
重组人胰岛素样生长因子-1（IGF-I）（R& D Systems，目录号：291-G1-200）
重组人成纤维细胞生长因子碱性（FGFb）（R& D Systems，目录号：233-FB-025）
L-抗坏血酸（Sigma-Aldrich，目录号：A5960）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A6003）
EDTA（Merck Millipore Corporation，目录号：1.08418）
培养基199（Sigma-Aldrich，目录号：M4530）
碳酸氢钠（7.5％）（Life Technologies，Gibco，目录号：25080-094）
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：25080-094"
HEPES（1M）（Life Technologies，Gibco，目录号：15630-080）注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：15630-080"
Pen Strep 100x（Life Technologies，Gibco，目录号：15140-122）
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：15140-122"
MEM非必需氨基酸溶液100x（Sigma-Aldrich，目录号：M7145）
丙酮酸钠100mM（Sigma-Aldrich，目录号：S8636-100）
GlutaMAX ^TM 100x（Life Technologies，Gibco，目录号：35050-061）
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：35050-061"
乙酸，冰（Chem Supply，目录号：AA009-2.5L）
结晶紫（Sigma-Aldrich，目录号：C3886-25g）
1x DPBS（请参阅配方）
0.1％BSA/DPBS（参见配方）
EGM-2带子弹套件的介质（参见配方）
白细胞计数液（见配方）
纤连蛋白（Roche Diagnostics，目录号：10838039001）（参见Recipes）
VEGF（参见食谱）
FGFb（参见配方）
抗坏血酸（见配方）
IGF-I（参见配方）
HUVE媒体+ 20％FBS（见配方）
EGM-2培养基+ FBS和生长因子（参见配方）
MACS缓冲区（参见配方）

设备

认证的生物安全柜
AutoMacs ^? Pro with chill 15 rack（Miltenyi Biotec，目录号：130-092-545）
移液器
移液枪具有设置缓慢的能力
用盖子离心机（Eppendorf AG，型号：5810R），用A-4-81转子
细胞计数装置（即血细胞计数器）
显微镜
CO <2>孵化器
对于手动细胞分选
MiniMACS ^{TM分离器（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-102）}
MACS MultiStand分离器（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-303）

程序

单元隔离
注意：AutoMacs 自动细胞分选是分离naEFCs的首选方法，但是使用MS列的手动方法包括是否无法访问AutoMacs ^?。
1. 从脐静脉收集40-250毫升的人脐带血来自健康孕妇，优选来自剖腹产的胎盘部分，进入脐带血收集袋
2. 转移脐带血通过切割收集袋的管和排水到50ml管中 25毫升血液直接进入每个管（注意，这个体积20毫升到期 ?到收集袋中的抗凝剂）
3. 用无菌DPBS稀释血液1：1，倒置管3-4次混合
4. 在新鲜的50ml管中加入15ml的淋巴细胞粘附分子（使用15ml的淋巴细胞粘附分子TM，无论管中的血容量如何）。
5. 使用25ml移液管小心地将35ml稀释的血液层置于lymphoprep TM上，用移液枪设定为慢速。做这个非常慢慢地，所以血液层和淋巴细胞层^TM层不混合（参见图3）。重复，直到所有稀释的血液分层 lymphoprep ^TM。最小化血液保留在的时间 lymphoprep ^TM。
  
  图3.密度离心前后单独的单核细胞。如（A）所示，血液层叠在上面小心地避免混合淋巴细胞。可以看到红细胞开始沉降。（B）显示了密度之后的预期层 ?离心。含有单核细胞的血沉棕黄层然后进行细胞分选。这是不寻常的脐血样本 ?有红细胞污染的血沉棕黄层，有大块外观至血沉棕黄层或血浆层出现红色 ?裂解的红细胞，这都是正常的
6. 立即在700离心机在室温下用制动器20分钟 ?并且加速度变为零以允许单核细胞（MNC）分隔。
7. 离心后，MNCs应该是可见的 ?在淋巴细胞增多物和血浆/DPBS之间的界面处的血沉棕黄层 ?层（见图3）。
8. 使用软件小心收集MNC 无菌球管转移吸管通过缓慢吸取血沉棕黄层细胞并将细胞转移到干净的50ml管（这可能需要 ?多个管，它有一个大样本的血液与多个 lymphoprep ^TM管）
9. 重复转移，直到每个淋巴管^TM管中没有血沉棕黄层。
10. 用50ml管中的HUVE培养基稀释转移的血沉棕黄层细胞1：1
11. 在室温下以450xg离心5分钟
12. 吸出上清液，将细胞重悬于10ml HUVE培养基中
13. 如果需要，将细胞合并到一个50ml管中。
14. 取样品进行细胞计数以确定总细胞数。计算50-250个细胞的范围以计算细胞数应该给出 ?足够准确的结果为本阶段的协议，适当体积和稀释以达到这个范围可能需要计算
15. 稀释细胞1：1（作为最小稀释）与白细胞计数液。离开混合2分钟，所以红细胞可以裂解为更准确的细胞计数。所有有核细胞将显示蓝色在血细胞计数器或等价物上计数。计数细胞并确定总细胞数。
16. 洗涤细胞两次以上重悬在25 ml HUVE培养基，随后在室温下以450×g离心5分钟温度。吸入上清液时，不要从中取出所有培养基重悬浮之前的沉淀以提高细胞产量
17. 吸出上清液，并在500μlHUVE培养基中重悬<1×10 8个细胞慢慢地上下吸取并转移到10ml管（如果有的话）超过1×10 8个细胞加入1ml的HUVE培养基并分成2个管并继续每个管）
18. 加入100μl的人FcR阻断然后加入100μl重悬的CD133微珠并混合均匀。 ?在4℃在黑暗中孵育30分钟。
19. 在4℃下以450×g离心管离心5分钟（用于手动细胞分选，进行下面的方案）。
20. 同时打开AutoMACS ^? Pro，并附上运行缓冲液，并按照制造商的说明进行冲洗循环。
21. 小心吸出上清液，通过轻轻地上下吹打，将细胞重悬在3ml无菌MACS缓冲液中
22. 在AutoMACS ^? Pro上选择"possel-s"（正数选择敏感），并按照设置所需的样本数制造商的说明
23. 使用冷冻AutoMACS ^? Chill 15机架 ?并将具有细胞的样品管插入位置1并且空的10ml管 ?到位置2（CD133阴性）和3（CD133阳性）。运行程序。
24. 组合所有CD133阳性分选细胞并执行细胞计数与根据步骤15的白细胞计数液进行测定播种的媒体量。
25. 在室温下以450xg离心5分钟。
对于手动细胞分选
1. 将miniMACS ^TM磁性分离器连接到MultiStand并插入MS 柱（每个样品1个）装入分离器并放置收集管下面列（这可以在制造商产品中看到信息表）。
2. 为了准备柱，加入500μlMACS缓冲液列的顶部，并允许流过列（它不会干涸）。丢弃收集管中的流体。
3. 吸出上清液（来自步骤A19）并将细胞重悬于1ml中无菌MACS缓冲液，轻轻地上下吹打
4. 添加单元格 ?悬浮液在柱顶部每次500μl。未标记的细胞将流入收集管。
5. 通过向柱中加入500μlMACS缓冲液来洗涤柱子。重复3次。
6. 从分离器中取出MS柱，并置于新的收集管上。
7. 向柱中加入1ml MACS缓冲液，并使用提供的柱塞 ?与柱，立即冲出积极标记的细胞牢牢地将柱塞向下推入柱子
8. 继续步骤A24。
初始细胞接种
1. 用每孔300μl的纤连蛋白涂布24孔板（约1-6 ?根据样品大小将需要孔）并留下孔板在设定为37℃的5％CO 2培养箱中至少30分钟
2. 用生长因子补充所需量的EGM-2培养基
3. 在具有生长因子的EGM-2中以1×10 6个细胞/ml的密度重悬CD133 +细胞。
4. 从孔中吸出纤连蛋白，不需要额外的洗涤
5. 向孔中加入细胞（每孔1-2ml）。
6. 将孔板置于设定为37℃的5％CO 2培养箱中，这被认为是第0天。
细胞培养（分离非粘附和粘附细胞）
1. 在从初始接种48小时（第2天）后，需要转移细胞 ?新的纤连蛋白包被孔以分离所需的非粘附物来自少量贴壁细胞的细胞
2. 外套新一个24孔 ?每个孔用300μl纤连蛋白离开孔板在设定为37℃的5％CO 2培养箱中至少30分钟。
3. 分离非粘附细胞，收集所有孔的所有非粘附细胞到10ml管中
4. 用1ml /孔的DPBS清洗所有孔，轻轻向上轻轻吹打 ?在每个孔中，并添加到非粘附细胞的管
5. 在室温下以450xg离心5分钟
6. 小心吸出上清液以避免吸出任何细胞沉淀和重悬细胞在新鲜EGM-2中与生长因子在a 密度为1×10 6个细胞/ml
7. 从中吸出纤连蛋白孔（不需要另外的洗涤），并加入细胞（1-2ml / 孔）至新的纤连蛋白包被的孔
8. 放置孔板进入设定为37℃的5％CO 2培养箱中，直到第4-5天，当均质时形成细胞群（参见图2的细胞实例人口在这个阶段）。

笔记

除血液收集和AutoMacs ^? Pro细胞分选之外的所有程序应在无菌条件下在使用无菌技术的认证生物??安全柜中进行。
在收集之前，需要有相关的人类伦理用于人类脐带血收集和研究使用。
在整个单核细胞和CD133阳性细胞数目中存在广泛的供体变化，并且一些样品显示出比其他样品更深或更厚。例如，与不同的样品相比，您可能从较小体积的血液中获得较高的细胞产量。从40-250ml血液，预期的CD133阳性细胞产量为5×10 5至8×10 6个细胞。理想地，应该收集最大体积的血液，但是如果经常受到捐赠者和分娩技术的限制，则脐带血收集不应该损害捐赠者的健康。
可以收集血液，并在室温下在摇床上在室温下在收集袋中放置过夜，但回收的细胞数目可以更低。
不要做特定的红细胞裂解步骤，因为它影响naEFCs生存力。轻微的RBC和其他细胞污染似乎有助于细胞活力，并且在选择性培养基中4天后CD133 ⁺细胞变得均质。

食谱

1x DPBS
在无菌水中稀释20x DPBS 1:20以获得1x DPBS
0.1％BSA/DPBS

DPBS
100 ml

BSA
0.1 g

将BSA溶解于DPBS中，然后通过0.2μm过滤器灭菌
EGM-2带子弹套件的介质
根据制造商的说明，将弹头套件的所有组件添加到EBM-2培养基瓶中，制成EGM-2培养基。
等分并存储在-20°C，直到使用
白细胞计数液

乙酸，冰醋
1 ml

水
49 ml

水晶紫
7.5 mg

溶解并混合好，然后用0.2μm过滤器灭菌在室温下贮存
稀释细胞进入这个准备和计数血细胞计数器
纤连蛋白
用无菌水重构1mg/ml，并在37℃放置30-60分钟，不搅拌溶解
将商品储存在-20°C
用无菌DPBS稀释1 mg/ml原液至50 mg/ml，用于
储存在4°C
VEGF
在无菌的0.1％BSA/DPBS中重构为5μg/ml 等分并储存在-20°C
FGFb
在无菌的0.1％BSA/DPBS中重构至25μg/ml 分装并储存在-80℃下
抗坏血酸
在无菌水中重构至0.5 M 等分并储存在-20°C
IGF-I
在无菌DPBS中重构至100μg/ml 在无菌DPBS中稀释至5μg/ml
分装并储存在-80℃下

HUVE媒体+ 20％FBS

中等199	400 ml
胎牛血清	100 ml
1 M HEPES	10 ml
7.5％碳酸氢钠	7.5 ml
100x GlutaMAX ^TM	5 ml
100x MEM非必需氨基酸溶液	5 ml
100x Pen strep	5 ml
100mM丙酮酸钠	5 ml

EGM-2培养基+ FBS和生长因子
表1. EGM-2媒体，FBS和生长因子配方

	稀释	要做到5ml	最终浓度
添加Bullet试剂盒的EGM-2培养基		4.5 ml
胎牛血清	（1/10）	500微升	10％
VEGF（5μg/ml）	（1/1,000）	5微升	5 ng/ml
IGF-1（5μg/ml）	（1/5,000）	1微升	1 ng/ml，
抗坏血酸（0.5M）	（1/5,000）	1微升	0.1 mM
bFGF（25μg/ml）	（1/25,000）	10微升	1 ng/ml

0.2μm无菌过滤器，立即使用

MACS缓冲区
100 ml 1x DPBS
0.5克BSA（0.5％） 0.074g EDTA（2mM） pH 7.2
0.2μm无菌过滤器
储存在4°C

致谢

我们感谢Sarah Appleby博士，Katie Tooley博士，Jeffrey Barrett博士和Samantha Escarbe在制定本议定书方面提供的帮助; Rosalie Grivell博士，妇女儿童医院和伯恩赛德纪念医院的工作人员和同意捐赠者收集脐带血。这个项目是由心脏基金会奖学金CSB（CR10A4983），以及来自生物标记物翻译合作研究中心（Trans Bio Ltd）的项目资助。

参考文献

Appleby，SL，Cockshell，MP，Pippal，JB，Thompson，EJ，Barrett，JM，Tooley，K.，Sen，S.，Sun，WY，Grose，R.，Nicholson，I.，Levina，，I.，Talbo，G.，Lopez，AFand Bonder，CS（2012）。循环人类非粘附内皮形成细胞的独特群体及其通过细胞间粘附分子的募集的表征-3。 PLoS One 7（11）：e46996。
Barrett，J.M.，Parham，K.A.，Pippal，J.B.，Cockshell，M.P.，Moretti，P.A.，Brice，S.L.，Pitson，S.M.and Bonder，C.S。（2011）。鞘氨醇激酶-1的过表达增强人内皮细胞中的祖细胞表型。微循环 18（7）：583-597。
这些研究结果表明，这些研究结果表明，在不同的温度条件下，不同温度条件下，。白细胞介素3大大扩展了非粘附内皮形成细胞，具有促血管生成特性。 Stem Cell Res 14（3）：380-395。
Parham，K.A.，Zebol，J.R.，Tooley，K.L.，Sun，W.Y.，Moldenhauer，L.M.，Cockshell，M.P.，Gliddon，B.L.，Moretti，P.A.，Tigyi，G.，Pitson，S.M.and Bonder，鞘氨醇1-磷酸是过氧化物酶体增殖物激活受体-γ的配体，其调节新血管生成。 a> FASEB J 29（9）：3638-3653。