材料和试剂

50ml Falcon管
无菌一次性塑料巴斯德移液器或无菌镊子
10厘米组织培养皿
T-25组织培养瓶
MW6组织培养板（Jet Biofil，目录号：TCP-011-006）
人体组织样本（结肠正常和肿瘤组织）
不含L-谷氨酰胺的Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）高葡萄糖（Lonza，目录号：BE12-614F）
L-谷氨酰胺（Lonza，目录号：BE17-605E）
Normocin ^TM（InvivoGen，目录号：ANT-NR-2）
青霉素/链霉素（Lonza，目录号：BE17-602E）
两性霉素B（Carl Roth GmbH + Co.，目录号：0246.1）
庆大霉素（Carl Roth GmbH + Co.，目录号：0233.2）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Lonza，目录号：BE17-516F）
胎牛血清培养基（FBS）（Biowest，目录号：S181B-500）
胰蛋白酶/EDTA（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：25200-056）
FBM& FGM-2子弹套件[Lonza，目录号：（CC-3131）和（CC-4126）]
注意：FBM& FGM-2 Bullet试剂盒在成纤维细胞生长培养基（FGM）试剂盒列表中（Lonza，目录号：CC-3132）。
DMEM（参见配方）
FBS与高浓度的抗生素（见配方）
FBS与正常浓度的抗生素（见配方）

设备

层流组织培养罩
解释器
37℃摇床
37℃和5％CO 2细胞培养箱中培养
离心机

程序

开始之前
1. 手术后立即保留结肠正常和肿瘤组织在Falcon管中用10ml高浓度的DMEM 抗生素以避免细菌或真菌污染。为此， DMEM补充有5％FBS，L-谷氨酰胺（1％），300U/ml青霉素， ?300μg/ml链霉素和5μg/ml两性霉素B
2. 组织将样品保持在4℃直至使用。建议最小化结肠手术和样品处理之间的时间
3. 确保您拥有所有必要的材料，试剂和设备。
洗涤样品：正常粘膜和肿瘤材料
1. Falcon管与来自结肠肿瘤或正常粘膜的人组织样品 ?在无菌下置于层流组织培养罩中条件。所需的组织的平均尺寸为1cm 。
  
  图1.手术结肠人类样品。肿瘤组织样品的代表性图像显示使用的平均尺寸。
2. 执行两次快速洗涤的组织样本用10毫升PBS每时间使用Falcon管和巴斯德移液管处理样品
3. 然后，将样品在10ml含有0.5mg/ml Normocin，0.5μg/ml两性霉素B和0.1mg/ml庆大霉素的PBS中孵育30分钟猎鹰管。在37℃振荡器中轻轻摇动。
解剖和种子样品：正常粘膜和肿瘤材料
1. 将组织样品转移至10cm组织培养皿。此时不要让样品变干。
2. 仔细分析样品：正常组织是脂肪和软的， ?而肿瘤组织是僵硬的，多模态到可变程度，和有时显示更多灌溉区域。
3. 用手术刀将组织样本切成约2-3毫米的小片。
4. 使用巴斯德移液管或无菌镊子种子组织片 T-25组织培养瓶与2ml补充有0.2的FBS mg/ml诺霉素，200U/ml青霉素，200μg/ml链霉素和0.1mg/ml 庆大霉素（Hanahan和Coussens，2012）。我们将这种媒介称为"FBS" 高浓度的抗生素"。在37℃下孵育T-25烧瓶 ?含有5％CO 2的潮湿气氛
5. 24小时后，它是相当用于从T-25烧瓶中除去培养基，用洗涤两次 PBS，并加入新鲜的"具有高浓度抗生素的FBS"培养基。当更换介质时，小心，并尽量保持片断 ?碟子。如果两天后细菌或真菌污染没有 ?出现，可选择将介质更换为"FBS与正常浓度的抗生素"（Berdiel-hacer等人，2014）：用0.1mg/ml诺霉素，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的FBS， ?如果污染持续，继续使用"高浓度的FBS 的抗生素"，如果五天后污染没有消失，丢弃样品。
6. 通常，出现成纤维细胞的生长 10天后，用补充的FBM替换培养基使用FGM-2 Bulletkit以促进成纤维细胞生长（Finak等人 2008）。成纤维细胞常规地保持在FBM培养基中 37℃，在含有5％CO 2的潮湿气氛中。更换介质两天。
成纤维细胞原代细胞培养物的扩增
1. 30-40天后，细胞培养通常相当大图1），除去组织的残余物，得到轻拍烧瓶
2. 成纤维细胞用PBS洗涤两次并胰蛋白酶化通过胰蛋白酶/EDTA在37℃下5分钟。使用血清培养基（FBS）阻断胰蛋白酶活性并在1,200rpm离心5分钟。之后，使用FBM培养基将成纤维细胞在MW6组织平板中接种
3. 然后，将成纤维细胞原代培养物以1比2传代培养（Navab等人，2011）在FBM培养基中并在37℃下在潮湿环境中维持含有5％CO 2的气氛。每两天更换一次培养基。主 CAF最初显示双极和/或多极形态，然后获得a ?均匀纺锤形形态并形成平行阵列和螺旋 ?在汇合。 α-sma和波形蛋白的表达和不存在可以通过免疫荧光分析细胞角蛋白（PanCK）以验证如在Herrera等人（2013）中所做的细胞培养物中的CAF富集。
  
  图2.建立和表征来自结肠癌患者的原发性CAF。 CAF的代表性图像文化沿着建立时间。比例尺=50μm

笔记

我们建议不要在每个T25烧瓶中放置超过5-6个，这有助于控制污染。如果需要，每个样品使用几个烧瓶。
我们优选使用具有高浓度抗生素的培养基"FBS"7-10天（每两天更换新鲜培养基）。
我们建议在12-14天后更换培养基到FBM，即使没有看到成纤维细胞
细胞数目可以最小化地扩展，尽管记住原代细胞在延长的体外培养后进入衰老。永生化可以使用适当的程序进行（Navab等人，2011）。

食谱

DMEM
5％FBS
L-谷氨酰胺（1％） 300 U/ml青霉素
300μg/ml链霉素
5μg/ml两性霉素BFBS，含高浓度抗生素
补充有0.2mg/ml诺霉素，200U/ml青霉素，200μg/ml链霉素和0.1mg/ml庆大霉素的培养基（Hanahan和Coussens，2012）。
FBS与正常浓度的抗生素
FBS与0.1mg/ml Normocin，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的缓冲液

致谢

此协议是Herrera等人（2013年）和Stanisavljevic等人（2015年）所描述的协议的扩展版本。
M. Eaude帮助了英文文本。该研究由来自Salud Carlos III-FEDER研究所的PI12/02037，RD12/0036/0041和RD12/0036/0021支持;由基金会西班牙 - FEDER竞争力部长SAF2010-20750;来自Comunidad de Madrid的S2010/BMD-2344;和桑坦德银行。 AntonioGarcíade Herreros的实验室得到RD12/0036/0005（来自Salud Carlos III-FEDER研究所）和SAF2013-48849-C2-1-R（西班牙经济部长FEDER的资助）的支持。 CristinaPe?a是来自Salud Carlos III学院的Miguel Servet合同的收件人。所有作者不存在利益冲突。我们感谢实验室成员在整个研究中的帮助和建议。

参考文献

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Hanahan，D。和Coussens，L.M。（2012）。犯罪附件：招募到肿瘤微环境的细胞的功能。 Cancer Cell 21（3）：309-322。
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Navab，R.，Strumpf，D.，Bandarchi，B.，Zhu，CQ，Pintilie，M.，Ramnarine，VR，Ibrahimov，E.，Radulovich，N.，Leung，L.，Barczyk，M.，Panchal， D.，To，C.，Yun，JJ，Der，S.，Shepherd，FA，Jurisica，I.and Tsao，MS（2011）。非小细胞肺癌中癌相关成纤维细胞的预后基因表达特征。 Proc Natl Acad Sci USA 108（17）：7160-7165。
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