材料和试剂

巴克管（Bellco Glass Inc.，目录号：2048-00150）
丁基橡胶塞（Bellco Glass Inc.，目录号：2048-11800A）
11 mm铝密封卷边（Wheaton，目录号：224176-01）（图1A）
20 mm铝密封卷边（Wheaton，目录号：224178-01）
18 G和22 G BD PrecisionGlide针（Becton Dickinson，目录号：305195）
22G BD PrecisionGlide针（Becton Dickinson，目录号：305155）
Hamilton气体注射器[1705 Sl50μlSyr（22s，2"，2）L]（Hamilton Company，目录号：80956）（图1）
自动进样器样品瓶（National Scientific，目录号：G4012-1W）**（图1A）
11毫米直塞塞，天然红橡胶（Wheaton，目录号：224100-030）**（图1A）
UHP 99.99％甲烷气罐（Airgas，型号：LW908）
Nalgene Labtop冷却器（Sigma-Aldrich，目录号：C2312-1EA）
Nalgene Labtop冷却器（Sigma-Aldrich，目录号：C2437-1EA）
1ml，5ml和10ml BD TB注射器（Becton Dickinson，目录号：309624,309632和309640）
15ml无菌聚丙烯Falcon锥形离心管（Corning，目录号：352196）
无菌PVDF注射器过滤器（17mm直径，0.2μm孔径）（Thermo Fisher Scientific，目录号：F25136）
20ml BD Luer Lok一次性注射器（Becton Dickinson，目录号：302830）
16×132mm mm 1型玻璃硼硅酸盐玻璃试管（Bellco Glass Inc.，目录号：2011-16125）**
16mm KAP-UTS试管帽，各种颜色（Bellco Glass Inc.，目录号：2007-16005）**
1ml微量移液管（Mettler-Toledo，Rainin，型号：L-1000）*
200μl微量移液管（Mettler-Toledo，Rainin，型号：L-200）*
20μl微量移液管（Mettler-Toledo，Rainin，型号：L-20）*
20μlHydroLogix SoftFit-L移液管吸头（VWR International，目录号：89031-366）*
200μlHydroLogix SoftFit-L移液管吸头（VWR International，目录号：89031-388）*
1 ml HydroLogix SoftFit-L移液管吸头（VWR International，目录号：89031-430）*
Envision纸巾（Georgia-Pacific，目录号：23504）
作为注射针的Hamilton气密锥形注射器（Hamilton Company，目录号：5181-8809）（图1）
UHP空气罐，带有调节器连接到GC（Matheson Tri-Gas ^?，型号：SG SPPULW700）
UHP氦气罐，调节器连接到GC（Matheson Tri-Gas ，型号：SG SPPULW800P）
UHP氮气罐，调节器连接到GC（Matheson Tri-Gas ，型号：LW 411P）
UHP氢气罐，调节器连接到GC（Matheson Tri-Gas ，型号：SG SPPULW500P）
ddH sub 2 O
莫匹罗星（Sigma-Aldrich，目录号：M7694）**
氢氧化钠（NaOH）无水粒料（Sigma-Aldrich，目录号：S8045-500G）
HS培养基
3-N-（吗啉代）丙磺酸盐（MOPS）（pH6.8）
UHP 100％氮气（Matheson Tri-Gas，型号：SG SPPULW411）
50 mM甲醇
厌氧溶液的一般准备（参见配方）
200x莫匹罗星储备（见配方）
普通介质（无C源）（参见配方）
2x C介质（见配方）
注意：
1. *材料和试剂仅用于厌氧条件。
2. **材料和试剂可用于厌氧和有氧条件。

设备

250ml烧杯（Thermo Fisher Scientific，目录号：FB-100-250）
厌氧室或手套箱（Coylab，型号：B型）（图2）
带有火焰离子化检测器的Agilent 7890A气相色谱仪（Agilent Technologies，型号：G3440A）
Agilent自动进样器（Agilent Technologies，型号：G4513A）
Agilent Technologies OpenLAB CDS ChemStation版本C.01.02
GS-CarbonPLOT GC柱（Agilent Technologies，目录号：113-3132）
安捷伦衬管4mm ID螺丝GW（安捷伦科技公司，目录号：5062-3587）
Merlin Microseal高压替代隔垫（Restek Corporation，目录号：22812）
IEC Medilite微量离心机（Thermo Fisher Scientific，目录号：004480F）（图2）
注意：设备用于厌氧条件。
Spectronic 20D +（Thermo Fisher Scientific，目录号：14-385-129）

软件

Agilent OpenLAB CDS ChemStation软件

程序

准备标准曲线

通过用空气冲洗制备自动进样器小瓶。塞子，卷曲和标签瓶（图1A）。
打开燃气阀和调节器的99.99％甲烷气罐。调节器装配有允许针安装到尖端中的杆（图3）。阀杆配有气密隔膜，以防止不需要的甲烷气体泄漏出水箱
使用50μl气密 Hamilton注射器（Reno，NV），将针插入末端调节器（图3）。确保旋塞阀处于关闭位置然后插入针。使用两个手指在两侧针，帮助引导针以防止针弯曲
一旦汉密尔顿注射器插入隔垫，打开活塞并且抽出超过所需量的甲烷（即如果需要50 ?μlCH 4，退出约55μl）。小心不要让柱塞注射器完全从注射器中取出
关闭活栓并从调节器的末端取出针（图2B-2C）。
打开活塞并从注射器中排出所需体积的气体
让气体平衡到大气压，然后关闭活栓。
将甲烷气体注入带塞/卷曲的自动进样器样品瓶中
在Agilent GC上运行甲烷捕获方法（详情如下所述）。

注入标准瓶中的99.99％甲烷的建议体积：5μl，10μl，20μl，30μl，40μl和50μl（图4）。
表1.气相色谱仪"甲烷"方法设置

进入
模式	不分页
清除流程	60分钟/0.75分钟
加热器	250℃
压力	31.529 psi
隔垫吹扫流量	3 ml/min标准
列
列类型	GS CarbonPLOT
流量	6.5 ml/min
压力	31.529 psi
Ave.速度	85.265cm/sec
恒定流量	是
后运行	7.3213ml/min
ALS注入量	2微升
烤箱
温度	145℃
保持时间	3分钟
FID检测器
加热器	300℃
H <2> 流程	30 ml/min
气流	400 ml/min
化妆流量（N <2）	25 ml/min
火焰	在

计算
1. 表S1。 GC甲烷计算指导用户制定甲烷标准确定培养物产生的甲烷的摩尔量。中电子表格，"变量"选项卡包含常量和变量用于计算。使用的常数符合Beadle Center，内布拉斯加大学林肯分校，但可以修改以容纳其他 ?大气和温度条件
2. 每次FID检测器需要产生标准曲线 ?打开。创建标准后，导出以下内容数据到Microsoft Excel：日期和时间，Sample_Name，Vial＃，保留时间（分钟），高度，区域和Injection_DataFileDirectory。复制和将导出的数据粘贴到附加的电子表格的"标准数据" 标签，确保数字不会作为文本传输，一切都在正确的列。如果使用Agilent OpenLAB CDS ChemStation软件，a ?可以创建只包括这些字段的报表布局电子表格的顺序。
3. 填写"标准数据"标签后 ?出来，用进样体积，样品瓶体积填充"常数"选项卡，和加入每个标准小瓶的甲烷气体的体积，对应于在"标准"选项卡上输入的内容。的电子表格将完成计算。创建标准曲线默认情况下为峰面积vs甲烷（nmoles）。重要的是要注意该标准曲线是注入GC中的甲烷的量（从每个自动进样器小瓶注射2μl）。这可以直接使用 ?与以相同方式在其他地方取样的2μl比较。的数量 nmoles没有乘以稀释因子表示整个自动进样器样品瓶中的摩尔数。（为一个 1.99 ml自动进样器样品瓶，稀释倍数为995.）
4. 什么时候使用由附加的电子表格创建的标准曲线，数据直接从GC中获得可以进行比较。完成结束时点测定，从每个样品获得的峰面积可以直接插入标准曲线方程。在动力学测定中，体积 ?需要调整以考虑到被移位的瓶体积细胞悬浮液（完全重悬细胞）。一次甲烷的量检测由GC计算，稀释因子必须使用计算给定顶空中甲烷的总量文化。
终点测定
1. 在Balch管中培养纯净或富集培养物至所需的光密度。例如，对于甲烷八叠球菌的纯培养物在含有125mM甲醇的HS培养基中35℃生长的乙酰化梭菌C2A 碳和能源与1：100接种早期固定相（OD 600 =?0.9）在50和75小时之间达到（Catlett等人，2015）。
2. 通过用空气冲洗制备自动进样器小瓶。塞子，卷曲和标签瓶。
3. 在通风橱中，取培养管和插入18 G针三 ?四分之一通过蓝色丁基塞（图5A）。不要将针完全推入塞子。
4. 使用气密 ?Hamilton注射器，将注射器针头插入18 G针（图5B）。确保Hamilton注射器活塞在关闭这一次（图2C）。 18 G针用作指导来帮助用Hamilton注射器针穿刺丁基塞子保持注射器针直。
5. 推入Hamilton注射器针通过丁基蓝塞子直到针的末端变得在培养管的顶部空间中可见（图5B）。一旦再次，不要将18 G针完全穿过塞子
6. 打开Hamilton注射器的活塞。快速和稳定撤回Hamilton注射器柱塞至所需体积顶空。（使用上述标准曲线时，最好 ?从培养物中取出50μl的顶空）体积的气体，迅速转动Hamilton注射器的活塞，密封注射器内的气体。不要让气体逃逸用大气压平衡（如A节）。取决于在生长培养中的压力，柱塞在Hamilton注射器上 ?可能会随着气体在注射器中膨胀而继续移动
7. 从文化的丁基塞子取出Hamilton注射器和18 G针。
8. 在Hamilton止回阀仍然关闭的情况下，将Hamilton注射器针头插入带塞和卷曲的自动进样器样品瓶中。
9. 打开活栓，将注射器中的所有气体注入自动进样器样品瓶。
10. 关闭活栓，从自动进样器样品瓶中取出Hamilton注射器
11. 一旦收集到所有培养物的顶空，将样品瓶放入自动进样器中。
12. 在GC上运行"甲烷"方法（表1）。
动力学测定
1. 开始之前，请准备以下材料和试剂完全厌氧，准备在腔室：莫匹罗星股票（3.5 mg/ml）（或合适的蛋白质合成抑制剂，您正在测定的生物体的磁敏度曲线），无菌16 mm ?试管，自动进样器样品瓶，自动进样器塞子和卷曲，IEC Medilite微量离心机。准备普通介质（不含碳来源），和生长培养基的第二股两倍碳源浓度（2×C培养基）。建议存储 ?这些储存在厌氧室中
2. 在Balch管中培养培养物至所需的光密度（指数期OD 600 =?0.3-0.5）。记录培养物的OD
3. 进入厌氧室：Balch管培养在4℃ Nalgene Labtop冷却器，无菌标记的微量离心管，自动进样器卷曲机，液体废物容器，固体废物容器，自动进样器样品架和镊子
4. 测量平原的量培养基和2xC培养基（表2）。加蛋白合成抑制剂至所需浓度。对于产甲烷菌，将莫匹罗星添加至70μM
5. 一旦物品被带入腔室中，轻轻地重悬在10ml培养物中的任何沉降的细胞。提取5 ml 使用注射器并置于无菌试管中。撤销剩余的 ?5 ml，并置于单独的试管中
6. 在离心机中以1228×g离心细胞培养物5分钟。
7. 滗析上清液并将每个沉淀重悬于5ml /试管中普通介质。使用注射器破碎沉淀并轻轻旋转避免溶解细胞
8. 在离心机中以1,228×g旋转重悬的细胞5分钟。
9. 当离心机运行时，将自动进样器样品瓶放在上自动进样器样品架。需要七个小瓶来测定一种菌株：用于样品重复的五个小瓶，仅培养基对照（培养基无细胞）和无底物细胞对照（细胞在纯培养基中只有，没有碳源）
10. 对于500μl细胞悬浮液，加入250μl ?2x C培养基至五个样品重复和仅培养基控制。添加250微升的普通培养基到中等和只无细胞对照（表2）
11. 当离心机停止时，立即倾析上清液。点击试管到一张纸上毛巾清除所有残留的介质。
12. 使用2ml普通培养基重悬并将丸粒合并成一个管。这应该是2毫升总每个10ml Balch管培养物重悬。保持在4°C冷 Nalgene Labtop Cooler。
13. 添加250微升的细胞悬浮液的样品重复和单元格的控制
14. 将200μl剩余的细胞悬浮液放入标记微量离心管。这将用于测量蛋白质浓度 ?通过Bradford测定
15. 压接和标签小瓶。镊子有助于将塞子和卷曲放置在每个小瓶上。
16. 从小室中取出小瓶，并置于35°C孵育器中5分钟，然后将小瓶放入GC自动进样器。
17. 使用"甲烷"方法进行七个小瓶序列的六次运行 Agilent GC（表1）。在重复之前，每个小瓶应按顺序运行用于下一次测量的序列，导致20-40分钟甲烷在测量之间积累在每个小瓶中
18. 至测量细胞悬浮液的蛋白质浓度，自旋下降200 ?μl细胞悬液在1500×g下在步骤14中保存3分钟。去掉上清液并用200μlddH 2 O重悬。溶解细胞并执行 Bradford，用考马斯试剂和2mg BSA标准。甲醇原细胞在HS培养基中生长的细胞容易通过渗透在ddH 2 O 2中重悬浮而溶解休克，但生物体生长在低渗透压介质或有细胞壁可能需要煮沸和/或冻融和涡旋或声波处理 ?完全溶解。
19. 绘制每个的甲烷峰面积对时间样品（图6）。使用斜率计算甲烷的量生产或消耗的时间（表S1。）。
  
  表2.动力学测定培养基体积和对照

代表数据

图1.压接器，气密性自动进样器样品瓶和气密的Hamilton注射器。A.压接器用于使用铝卷和橡皮塞密封自动进样器样品瓶。 Hamilton注射器显示开放（B）和关闭（C）路厄配件

图2.双面定制Coy厌氧室显示Medlite临床离心机（蓝色盖）

图3.装有隔垫的甲烷气罐

图4.示例标准曲线

图5.制备气体标准品和取样气体上部空间的方法。A.将18 G针推入塞子约四分之三的距离。这用作引导Hamilton针穿过塞子而不弯曲的引导。 B.将Hamilton注射器插入18G针中，并推动通过其余的塞子。一旦汉密尔顿注射器针的端部通过塞子的末端（箭头），可以提取顶部空间。不要将Hamilton注射器推入塞子，18 G针通过塞子，因为这将允许顶部气体快速逸出。

图6.实例动力学测定结果

食谱

注意：

准备厌氧溶液是一项技术技能。有关一般说明，请参阅Wolfe和Metcalf（2010）。
一些甲烷八叠球菌的甲烷八叠球菌种可在培养基中生长不同的渗透压（低盐，LS或高盐，HS）培养基（Sowers等人，1993）。如果生长其他产甲烷菌或甲烷营养菌，使用感兴趣的生物体的适当的培养基配方。

200x莫匹罗星股票
1. 在厌氧条件下，塞子并卷曲空的Balch管。高压灭菌。
2. 将35mg莫匹罗星溶解在0.5ml 1M NaOH中的15ml Falcon管中
3. 用ddH 2 O完全体积至10ml。莫匹罗星在200x储备溶液中的最终浓度为3.5mg/ml（14mM）
4. 使用无菌技术，将22 G针头安装到无菌的17 mm直径 0.2μm孔径PVDF注射器过滤器，使用塑料20ml注射器。慢慢推动溶液通过过滤器，通过针，和进入无菌厌氧Balch管
5. 使用真空涡流技术使莫匹罗星储备液厌氧（Wolfe和Metcalf，2010）。
6. 储存于4°C长达一个月。
普通介质（无C源）
遵循与往常一样的培养基配方，但省略碳源。对于不能从CO 2产生甲烷的产甲烷菌如乙酸甲烷八叠球菌，制备正常的HS培养基。对于可以固定CO 2的产甲烷菌和自养生物，碳酸盐，碳酸氢盐和CO 2气体也应当从配方中消除并且在适当的pH下用缓冲液替换。例如，对于可以从CO 2产生甲烷的甲烷八叠球菌物种，正常HS培养基配方中的碳酸氢盐用50mM 3-N-（吗啉代）丙磺酸盐（ MOPS）（pH6.8）中，并在100％氮气下将培养基喷射并分配到Balch管中
2x C介质
将两倍浓度的碳源加入纯培养基（无C源）。例如，当测定在HS培养基上生长的甲烷八叠球菌时，如果测定中所需的最终浓度是50mM甲醇，则向Plain HS培养基中加入100mM甲醇以制备2x C HS培养基。

致谢

该材料基于国家科学基金会授予的IOS-1449525和MCB-1449014，由水环境研究基金会授予NTRY6R14支持的工作，以及内布拉斯加州能源科学周期8中心授予N. Buan。 M.史密斯由美国微生物学会本科研究奖学金和百事可乐结盟奖。在本材料中表达的任何意见，发现，结论或建议是作者的，不一定反映资金来源的意见。作者声明没有竞争的利益。

参考文献

Berndt，M.E.，Allen，D.E。和Seyfried，W.E。（1996）。在300°C下橄榄石蛇纹石化期间还原CO 和500巴。地质 24：351-354。
Catlett，J.L.，Ortiz，A.M.and Buan，N.R。（2015）。重新发送细胞电子通量以提高生物甲烷产生的速率。应用Environ Microbiol 81（19）：6528-6537
Dry，M.E。（2002）。费 - 托过程：1950-2000 。

111，227-241。
Horita，J。和Berndt，M.E。（1999）。在水热条件下的无生物甲烷形成和同位素分馏科学 285（5430）：1055-1057
Metcalf，WW，Griffin，BM，Cicchillo，RM，Gao，J.，Janga，SC，Cooke，HA，Circello，BT，Evans，BS，Martens-Habbena，W.，Stahl，DAand van der Donk， 2012）。海洋微生物合成甲基膦酸：有氧海洋中甲烷的来源。 337（6098）：1104-1107。
Sowers，K.R.，Boone，J.E。和Gunsalus，R.P。（1993）。分解甲烷八叠球菌并在升高的摩尔渗透压浓度下作为单细胞生长。 Appl Environ Microbiol 59（11）：3832-3839。
Thauer，R.K。（1998）。甲烷生成的生物化学：对Marjory Stephenson的致敬。 1998 Marjory Stephenson Prize Lecture。 Microbiology 144（Pt 9）：2377-2406。
Wolfe，R.S.（1982）。产甲烷生物化学。 Experientia 38 198-201。
Wolfe，R.S.and Metcalf，W.W。（2010）。用于制备缺氧溶液或液体培养基的真空涡流技术，用于培养产甲烷菌或其他严格的厌氧菌。 16（3）：216-219。