材料和试剂

注射器（1ml和60ml）和针（24和27号）（Becton Dickinson，目录号：309659和309653）
单刃剃刀刀片（IDL TechniEdge，目录号：05-091C）
双刃剃刀刀片（Electron Microscopy Sciences，目录号：72002-10）
Costar Netwell插入件，带440μm聚酯网（Corning，目录号：3478）
Corning测定板，具有非结合表面的黑色384孔（Corning，目录号：3575）
锥形管（15ml）（BD Biosciences，目录号：REF352196）
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Falcon ，目录号：REF352196" />
微量离心管（1.5ml）（VWR International，目录号：20170-038）
气溶胶屏障移液管吸头（30μl和200μl）（Thermo Fisher Scientific，目录号：02-707-33和02-707-42）
一次性转移移液管（Thermo Fisher Scientific，目录号：13-711-9AM）
玻璃板（Electron Microscopy Sciences，目录号：70312-22）
玻璃染色皿（Newcomer supply，目录号：6816A）
粗烧玻璃起泡器（Corning，目录号：39533-12EC）
整合培养皿（Becton Dickinson，Falcon，目录号：351112） />
成年（47-57天龄）雄性和雌性Sprague Dawley大鼠（Harlan Laboratories）
Hit-Hunter IP Sub 3荧光偏振测定试剂盒（DiscoveRx公司，目录号：90-0037）
70％高氯酸（HClO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：244252）
完全蛋白酶抑制剂混合物片剂（Roche Diagnostics，目录号：11697498001）
快速起始牛血清白蛋白（BSA）标准品（Bio-Rad Laboratories，目录号：500-0206）
蛋白质测定试剂（Bio-Rad Laboratories，目录号：500-0006）
戊巴比妥钠溶液（Virbac，目录号：710101）
氯化钙溶液（CaCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：21115）
氯化镁溶液（MgCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：M1028）
超级胶（Super Glue Corporation，目录号：SGP3）
70％乙醇（Thermo Fisher Scientific，Decon labs ^{TM，目录号：04-355-305）}
95％O 2/5％CO 2气体混合物（Airgas，目录号：XO2OX95C2003102）
NaCl
NaHCO 3
葡萄糖
KCl
NaH 2 PO 4 sub
HEPES（pH 7.4）
EGTA
原钒酸钠
NaF
焦磷酸钠
PMSF
人工脑脊液（aCSF）（参见配方）
蔗糖aCSF（s-aCSF）（参见配方）
HEPES匀浆缓冲液（见配方）

设备

剪刀（精细科学工具，目录号：14000-12和14060-10）
镊子（Stoelting，目录号：52104-37和52104-35）
Hemostat（精细科学工具，目录号：13008-12）
刮刀（Thermo Fisher Scientific，目录号：S50822）
Accuspin micro 17R微量离心机（Thermo Fisher Scientific，目录号：13-100-676）
生物光度计（Eppendorf AG，目录号：6133000010）
Leica VT1200S振动刀片切片机（Leica Biosystems Nussloch GmbH，目录号：1491200S001）
Isotemp 105水浴（Thermo Fisher Scientific，目录号：S63077Q）
Qsonica Q500超声波仪（Thermo Fisher Scientific，目录号：15-338-282）
Synergy 4多模微板读数器（BioTek Instruments）
蒸汽压渗透压计5520（Wescor）
Accumet AB15 plus pH计（Thermo Fisher Scientific，目录号：13-636-AB15PC）
旋转器（Labline Instruments）
微量移液器（2-20μl，20-200μl和100-1,000μl）（Capitol Scientific，Eppendorf，目录号：3120000038,3120000054和3120000062）

程序

横向海马切片的制备和治疗
1. 开始操作之前
  1. 每个大鼠放置?200 ml s-aCSF -80℃下约40分钟以形成浆状物（如果s-aCSF为预冷在4℃下形成的泥浆将更快，在15-20分钟内）。
  2. 将网室插入玻璃染色皿350毫升规则 aCSF（用95％O 2/5％CO 2混合物连续氧化）玻璃鼓泡器），并将盘放入34-35℃的水浴中20分钟在切片准备之前。
  3. 倒入20-30 ml s-aCSF浆液小玻璃烧杯中，将烧杯置于冰上并用95％O 2/5％ ?CO 2混合物，使用粗玻璃起泡器10-15分钟。
  4. 通过将冰放在冰室中预冷切片机台将双刃剃须刀刀片连接到刀片架（图2A）。
  5. 使用镊子弯曲27号针（约45度）的尖端，并将其放置在1ml??注射器。
2. 用戊巴比妥钠（125mg/kg，i.p。）深度麻醉大鼠，并使用手术剪刀和镊子进行剖腹术直到心脏是完全暴露的。用a夹住胸骨的尖端止血并将止血钳放在头上。
3. 用冰冷的含氧（95％O 2/5％CO 2）s-aCSF（?50ml /大鼠）经心脏灌注。
  注意：执行步骤A3的估计时间约为25秒。
4. 立即取下头，迅速在中间做一个切口的头皮，拉着皮肤，沿着颅骨切开顶叶中线缝合。去除颅骨板，小心地使用刮刀提取大脑，并将其转移到氧化和预冷却的s-aCSF中约1分钟 ?分钟。
  注意：执行步骤A4的估计时间小于a 分钟。
5. 将大脑放在冰上的玻璃板上（图1A）。沿着纵向裂缝对脑进行半切（图1A，虚线线1），并且相对于冠状面进行两个45度角切割（图1A，虚线2和3），产生组织块含有海马（图1B）。
  
  图1. 。在一块玻璃板的Perfused老鼠脑子在冰。虚线表示其中进行切割并且数字指示切割的顺序。乙。阻塞的大脑与两个半球分离。 C.一个半球大脑安装在安装盘上的Leica VT1200S振动切片机
6. 在中心放一小滴超级胶水 ?安装盘，小心地将一个半球放在胶水滴上（图1C），并转移到切片阶段 ?振动切片机（图2A）
  
  图2。 A. Leica VT1200S 振动刀片切片机与阶段预冰与冰。乙。使用切片机切割的两个横切片（300μm）剩余的组织块。
7. 立即用s-aCSF浆液覆盖组织并切割300μm切片（图2B）。
8. 将部分转移到Netwell插入物的单独的孔中（图3A），使用一次性转移移液管，并让部分在含氧的常规aCSF中在34-35℃下回收30-60分钟。确保所述部分平放在每个插入物的网格上，而不是浮动或移动
  
  图3。 A.切片的恢复和治疗建立。 B.在整合培养皿上显示单个切片解剖海马。海马以虚线勾画在切片的中间
9. 恢复后，切片准备实验治疗。治疗切片在氧合正常 aCSF与载体或感兴趣的药理学试剂。治疗时间应根据经验确定（秒至分钟）。每只动物的切片应均匀分布在载体和之间 ?治疗组。我们为每个样品集中四个切片，通常每个样品产生300-400μg总蛋白。
10. 治疗后，使用一次性转移移液管，立即将切片转移入整合培养皿中加入?20ml的0.2N高氯酸溶液在常规aCSF中由70％高氯酸制备以稳定IP 3和在室温下孵育2分钟。快速更换高氯酸-aCSF 与常规aCSF和将整体培养皿放在冰上。
11. 从冰上的常规aCSF中的每个切片快速解剖海马（图3B），使用具有弯曲针的1ml注射器，针尖，迅速转移每个海马1.5毫升微量离心管用300μl冰冷HEPES匀浆缓冲液（每25ml缓冲液1片）。
组织匀浆和蛋白质定量
1. 使用超声波仪在冰上匀浆组织（2次，3秒脉冲，使用40％振幅设置），保持微量离心管稳定，并且超声波探测器尖端以一半的方式浸入液体中 ?以避免起泡。
2. 离心组织匀浆[3,000 rpm（1,000×g/g）在4℃下10分钟]以除去未破碎的细胞和细胞核。 ?丢弃沉淀。
3. 测量每种蛋白质的浓度样品。简言之，制备具有已知BSA的标准品 ?（1mg/ml原液）浓度和未知样品在双蒸水。加入Bradford蛋白测定试剂，并在室温下孵育5 ?min。使用分光光度计测量595nm的吸光度。构建标准曲线，使用来自标准品的吸光度值并确定基于标准曲线的每个样品的蛋白质浓度。
4. 将每个样品中的蛋白质浓度调整到相同的值（例如 2 ?μg/μl）使用具有蛋白酶的冰冷HEPES匀浆缓冲液抑制剂。
测量IP ₃级别
1. 用70％乙醇喷洒在台面上，彻底清洁。确保在无尘环境中进行IP ₃测定
2. 完全解冻IP <3>试剂盒试剂，并在使用前平衡至室温。
3. 稀释IP sub 3标准品（20μM储备液）以制备10个3倍系列使用IP <3>标准稀释缓冲液稀释。对于空白，请使用 ?IP ₃标准稀释缓冲液。
4. 吸取10μl的空白，标准品，每份样品（每份样品20μg蛋白质）一式三份 ?孔的384孔测定板具有非结合表面阻挡尖端
5. 向每个孔中加入10μlIP sub 3示踪剂，随后加入20μL μlIP 3 Sub结合蛋白，并通过上下吸移数次来充分混合次。
6. 仔细检查板的气泡。如果气泡形成，他们用屏障移液器吸头。使用时避免交叉污染每个井的新提示。将板在室温下孵育30分钟 ?在温和混合（?60rpm）的旋转器上黑暗
7. 阅读具有多模的IP 3+示踪剂的荧光偏振信号酶标仪和荧光偏振滤光片，使用485nm 激发和530nm发射波长
8. 绘制标准曲线 ?并计算每个样品中的IP 3 3浓度（nM范围内海马）。除了绝对浓度值，IP <3>水平对于每个车辆和实验组也可以报告相对 ?基线（无治疗对照）。

食谱

人工脑脊液（aCSF，应清新）
126 mM NaCl 26mM NaHCO 3/v/v 10mM葡萄糖 3 mM KCl
1.25mM NaH 2 PO 4>/
2mM CaCl 2 2 / 1mM MgCl 2
使用2N HCl或5N NaOH将pH调节至7.4 测量摩尔渗透压浓度（300-310 mOsm）
蔗糖aCSF（s-aCSF，应清新）
75mM蔗糖 75mM NaCl 25mM NaHCO 3/v/v 15mM葡萄糖 2.4mM丙酮酸钠 2 mM KCl
1.3mM抗坏血酸
1.25mM NaH 2 PO 4>/
3mM MgCl 2/
0.5mM CaCl 2·h/v 使用2N HCl或5N NaOH将pH调节至7.4
HEPES匀浆缓冲液（可在4℃储存至三个月）
4mM HEPES（pH7.4） 320mM蔗糖 2 mM EGTA
1mM原钒酸钠 50mM NaF 10mM焦磷酸钠 20 mM甘油磷酸盐 0.1mM PMSF
在15 ml锥形管中使用前加入蛋白酶抑制剂混合物

致谢

这项研究得到国家卫生研究院资助R01 NS037324，妇女健康研究办公室和西北大学高通量分析设施的支持。

参考文献

Tabatadze，N.，Huang，G.，May，R. M.，Jain，A.and Woolley，C.S。（2015）。海马中抑制性突触的分子信号传导中的性别差异 J Neurosci 35（32）：11252-11265。