材料和试剂

一次性2 ml塑料微量离心管
1.5ml玻璃小瓶（Agilent Technologies，目录号：5182-0715），螺旋盖（Agilent Technologies，目录号：5182-0717）和200μl玻璃插入物（Agilent Technologies，目录号：5182-0549）
AcroVac过滤器单元（Pall Life Sciences，目录号：AVFP02L）
氯仿（HPLC级）（Thermo Fisher Scientific，目录号：C607）
L-色氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：T0254）
L-犬尿氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：K8625）
3-硝基-L-酪氨酸（硝基酪氨酸）（Sigma-Aldrich，目录号：N7389）
甲醇（HPLC级）（Thermo Fisher Scientific，目录号：A452）
乙腈（HPLC级）（Thermo Fisher Scientific，目录号：A998）
无水磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Thermo Fisher Scientific，目录号：P285-500）
无水磷酸氢钾（K 2 HPO 4）（Thermo Fisher Scientific，目录号：P288-500）
PIPES（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP292450）
EDTA（Thermo Fisher Scientific，目录号：S311-500）
犬尿酸（Sigma-Aldrich，目录号：K3375）
喹啉酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：P63204）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
50％甲醇/50％3mM PIPES-3mM EDTA（pH7.4）（参见配方）
含2.7％（v/v）乙腈的磷酸钾（pH6.4）（见配方）
标准混合（见配方）

设备

冷冻式台式离心机
带有二元泵，自动进样器和UV二极管阵列检测器（DAD）（Agilent Technologies，型号：1100）的HPLC系统
Hypersil GOLD C18柱（50mm，直径2.1mm）（Thermo Fisher Scientific，目录号：25003-052130）

程序

色氨酸和犬尿氨酸提取
1. 该协议需要至少1×10 6个细胞来精确检测色氨酸和犬尿氨酸水平。如果是色氨酸和犬尿氨酸需要从新鲜培养基中定量，收集2ml新鲜培养基然后加入细胞用于随后的分析并在-80℃下冷冻。该样品将用于测量色氨酸的基线水平和犬尿氨酸。
2. 如果感兴趣的细胞是粘附的细胞，然后进行步骤A2a。如果感兴趣的细胞悬浮细胞，然后进行步骤A2b。如果需要，细胞培养物可以是掺入内标如3-硝基-L-酪氨酸（最终浓度一般为20-50μM为宜）。的内标可用于定量代谢物的恢复
  1. 在 ?完成治疗方案，收集2ml培养基于2ml 微量离心管。在4℃下在离心机中离心2000×g离心颗粒细胞/来自培养基的碎片。在不干扰颗粒的情况下，转移介质转移到两个等体积的标记管中。将使用一个用于立即分析，而另一个将用作备份。在这点，无细胞，离心培养基可以储存在-80℃ 直到分析。可以通过HPLC分析培养基而不需要萃取。接下来，吸出板/烧瓶中的剩余介质细胞生长。用冷（4℃）磷酸盐缓冲盐水洗细胞（PBS）两次。然后，从培养板/烧瓶中取出细胞刮。收集释放的细胞，并放入2毫升微量离心机管。在离心机中在4℃下以2,000×g离心。继续步骤
  2. 在完成治疗计划后，收集所有介质包含在合适体积的锥形管中。离心机 ?在离心机中在4℃下以2,000×g离心，以从培养基中沉淀细胞/碎片。在不打扰沉淀的情况下，将1ml培养基转移到两个标记的培养基中管。一个将用于立即分析，而另一个将充当备份。此时，无细胞，离心培养基可以储存在-80°C直到分析。可以通过HPLC分析培养基无需提取。接下来，用冷的洗涤沉淀的细胞（4 ℃）磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤两次。继续执行步骤A3。
3. 在4℃下以2,000×g离心细胞并吸出PBS 干扰细胞沉淀。保持细胞在冰上，同时移液PBS。至猝灭代谢和提取代谢物，加入200μl冰冷的50％甲醇/50％PIPES-EDTA至细胞沉淀。
4. 到淬火的电池 ?混合，加入200μl冰冷的氯仿，并剧烈涡旋45 min。（注意：这个提取长度很重要从包括细菌的细胞壁的生物体中提取代谢物 ?和酵母。更短的提取时间5-10分钟就足够了哺乳动物细胞。剧烈涡旋对代谢物最有效萃取。建议使用多管涡流混合器头。）然后，在4℃下以21,000×g离心10分钟。
5. 收集上部，水/甲醇相在干净的标记管中。这是第一种代谢物提取物。将管放在冰上。
6. 通过加入200μl冰冷的50％甲醇/50％PIPES-EDTA。涡旋1分钟，并再次在4℃下以21,000×g离心10分钟。
7. 正如之前收集上部，水/甲醇与步骤A5的提取物。冻结提取物直至分析。
色氨酸和犬尿氨酸的检测和定量
1. 分析细胞培养基和细胞提取物的代谢物 HPLC。要分离和量化色氨酸和犬尿氨酸，注射5-20μl ?（注意：所需的进样体积将根据不同而有所不同代谢物在样品中的浓度，是推荐的范围。）的从步骤A7获得的细胞提取物中，收集用过的培养基 ?，或在HPLC中从步骤A1收集的无细胞培养基配有超灵敏二极管阵列检测器和Hypersil GOLD C18柱（50×2.1mm，3μm），其为反相柱填充球形，完全多孔的超纯二氧化硅。设置列温度保持在30℃。使用等度流动相 15mM磷酸钾（pH6.4），含2.7％（v/v）乙腈，a 流速0.8ml/min。运行时间应设置为10分钟。
2. 定量显示在286 nm处的吸光度的峰下面积 360 nm计算色氨酸和犬尿氨酸的浓度，分别在样品中。生成从0到的标准曲线 ?200μM对于色氨酸和犬尿氨酸以及其他代谢物利息以及任何内部标准（如果适用）使用正宗标准。应制备每种浓度的标准品一式三份并一式三份测量。标准混合的食谱是 ?包括在"食谱"部分。
  注：标准曲线的详细信息生成将根据色谱系统和数据而变化分析软件。请参阅制造商的文档使用您的仪器软件生成标准曲线。

代表数据

图1.显示色氨酸，犬尿氨酸，犬尿烯酸和硝基酪氨酸标准品分离的HPLC色谱图。喹啉酸盐也存在于标准混合物中，但低于定量限。上图显示360nm处的吸光度，下图显示286nm处的吸光度。也可以分离色氨酸代谢物犬尿酸和3-硝基-L-酪氨酸（硝基酪氨酸），其可以用作内标。所有分析物以12.5μM的浓度存在。标准溶液如配方部分所述制备。

笔记

可以通过使用由含有2.7％乙腈的10mM甲酸铵（pH 6.4）组成的流动相来修改该方法以与液相色谱 - 质谱法的相容性。其他色谱条件保持不变。如果需要，可以在提取之前将已知量的3-硝基-L-酪氨酸加入样品中用作内标。

食谱

50％甲醇/50％3mM PIPES-3mM EDTA（pH7.4）
1. 制备3mM PIPES-3mM EDTA（pH7.4）（500ml）混合0.453g PIPES和0.438g EDTA在400ml无菌水（HPLC级）中。后溶液变得完全溶解，完全达到500ml 无菌水。筛选解决方案。
2. 将上述物质与500ml甲醇（HPLC级）混合
3. 脱气并储存在4°C。
15mM磷酸钾，pH 6.4，用2.7％（v/v）乙腈（对于1L）制备1M一级无水（KH 2 PO 4 PO 4）和无水二碱价（K 2 SO 4 PO 4）的1M储备溶液， >）。
1. 将72.2ml的KH 2 PO 4和27.8ml的K 2 HPO 4稀释液与900ml无菌的水（HPLC级）以制备100mM储备液。
2. 取150毫升的100毫米原液，用850毫升无菌稀释水（HPLC级），得到15mM磷酸钾储备液。过滤解决方案
3. 运行HPLC分离时加入适量的新鲜乙腈（HPLC级）。
4. 脱气并在室温下储存。
标准混合物（色氨酸，硝基酪氨酸，犬尿氨酸，犬尿喹啉酸和喹啉酸各200μM）
1. 分别制备每种标准品，浓度为1mM，溶于50ml 流动相[15mM磷酸钾（pH 6.4），含2.7％乙腈]。对于每种溶液，称取适量的每个标准品并置于50ml容量瓶中。记录实际每个标准的质量
2. 向每个容量瓶中加入50ml移动 ?相和混合。标准，特别是犬尿酸，可能需要超过一个小时去解决。可以向每个添加搅拌棒并在搅拌盘上搅拌以促进溶解标准。
3. 当每个溶液准备好，添加2毫升的每个标准1 ?mM标准溶液至15ml管和涡旋混合物。最后该标准品中各标准品的浓度为200μM。根据需要进行重复连续稀释以制备一系列用于产生标准曲线的标准。
  注意：Serial 标准品的稀释度通常令人满意，但可以繁殖如果储备溶液浓度不正确，浓度误差。

致谢

这项工作由NIH拨款1R01CA135401-01A1和美国退伍军人事务部的医疗服务1R01DK082690-01A1和Dialysis Clinics，Inc。（DCI）（全部给R.H.W。）支持。这项工作部分在生物医学加速器质谱研究资源中进行，该研究资源在美国能源部在合同DEAC52-07NA27344的主持下在LLNL操作。研究资源由国家卫生研究院，国家综合医学科学研究所支持，授予P40 RR13461。提取方案改编自Villas-Boas等人（2005）。 HPLC方法改编自Laich等人（2002）。

参考文献

Laich，A.，Neurauter，G.，Widner，B.and Fuchs，D。（2002）。通过HPLC同时测量色氨酸和犬尿氨酸的更快速方法。 Clin Chem 48（3）：579-581。
Villas-Boas，S.G.，Hojer-Pedersen，J.，Akesson，M.，Smedsgaard，J.and Nielsen，J。（2005）。酵母的全球代谢物分析：样品制备方法的评估酵母 22（14）：1155-1169。
Wettersten，HI，Hakimi，AA，Morin，D.，Bianchi，C.，Johnstone，ME，Donohoe，DR，Trott，JF，Aboud，OA，Stirdivant，S.，Neri，B.，Wolfert，R.，Stewart ，B.，Perego，R.，Hsieh，JJand Weiss，RH（2015）。通过联合蛋白质组学和代谢组学分析显示的肾癌中级别依赖性代谢重编程。 em> Cancer Res 75（12）：2541-2552。