材料和试剂

1.5ml微量离心管（聚丙烯，热原，RNase，无DNA酶）
带有Ultracel-30膜的Amicon Ultra 0.5ml离心过滤单元（Merck Millipore Corporation，目录号：UFC503024）
50ml锥形离心管（VWR International，目录号：21008-714）
24孔细胞培养板，平底，TC处理（Genesse Scientific，目录号：25-107）
H1299细胞（ATCC，目录号：CRL-5803）注意：在该方案中使用组成型表达不稳定增强型绿色荧光蛋白（dGFP）的H1299细胞，通过流式细胞术快速测定RNAi应答。
GFP和非靶向siRNA（RNN亚磷酰胺和寡核苷酸合成描述于Meade等人，2014），RNN序列（5'至3'）：
1. GFP过客链：C CACU ACCUGAGC ACC A CAGU
2. GFP引导链：CU GGGU GCU CAGGU AGU GGU _S T
3. 非靶向过客链：U亚基GAGA A GAUCCUCA亚基UAA A亚基AGAU亚基> T
4. 非靶向引导链：U S UUUA S UGA S S GGAUC SubSUU S sub > CAU _S T
5. 关键词：下标D =二甲基 - 丁基磷酸三酯组，下标A ?=醛A-SATE磷酸三酯组，下标S = t Bu-SATE 磷酸三酯组
UltraPure DNase/RNase-free蒸馏水（Life Technologies，Invitrogen，目录号：10977023）注意：目前，它是"Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，目录号：10977023"。
TAT递送结构域（DD）Hynic肽，3T3S-Hy [TAT = RKKRRQRRR，3T3S-Hy序列：HyNic-GG-（TAT）-PEG18-（TAT）-PEG18-（TAT）]
乙腈（ACN），无水（Glen Research，目录号：40-4050-50）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
HEPES（AmericanBio，目录号：AB00892）
苯胺（Alfa Aesar，目录号：A14443）
乙酸，Glacial（Thermo Fisher Scientific，目录号：MAX00739）
干冰
40％丙烯酰胺/双溶液（19:1）（Bio-Rad Laboratories，目录号：161-0144）
10x Tris-硼酸盐-EDTA（TBE）缓冲液（Mediatech，目录号：46-011-CM）
过硫酸铵（VWR International，目录号：EM-2300）
10％（w/v）十二烷基硫酸钠（SDS）溶液（Bio-Rad Laboratories，目录号：161-0416）
N，N，N'，N'-四甲基乙二胺（TEMED）（VWR International，目录号：EM-8920）
去离子水
Orange G（Sigma-Aldrich，目录号：O-3756）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
SilverQuest银染试剂盒（Life Technologies，Novex?，目录号：LC6070）
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，目录号：LC6070"。
DMEM，高葡萄糖（Life Technologies，Gibco，目录号：11965-092）注意：目前，它是"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：11965-092"。
胎牛血清（FBS），热灭活（Omega Scientific，目录号：FB-02）
青霉素 - 链霉素（10,000U/ml）（Life Technologies，Gibco，目录号：15140-122）
注意：目前，它是"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15140-122"。
磷酸盐缓冲盐水（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP665-1）
Opti-MEM减少的血清培养基（Life Technologies，Gibco，目录号：31985-070）注意：目前，它是"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：31985-070"。
0.05％胰蛋白酶-EDTA，酚红（Life Technologies，Gibco，目录号：25300-054）注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：25300-054"。
5x siRNN共轭缓冲液（见配方）
0.4％SDS非变性聚丙烯酰胺凝胶溶液（见配方）
0.4％SDS-PAGE电泳缓冲液（见配方）
1x 0.4％SDS非变性上样缓冲液（参见配方）

设备

Rotisserie（Barnstead International，型号：Labquake 4001100）
冻干器（SP Scientific，VirTis，型号：Freezemobile 25EL）
微量离心机（Eppendorf，型号：5424）
UV分光光度计（能够测量260nm处的吸光度）
聚丙烯酰胺凝胶浇铸台和带有1.5mm间隔物的玻璃（Bio-Rad Laboratories）
凝胶流动装置（Bio-Rad Laboratories，型号：Mini-PROTEAN 3 Cell）
凝胶染色皿
Gel Doc（Bio-Rad Laboratories，型号：Molecular Imager Gel Doc XR + System）
台式离心机（Beckman Coulter，型号：Allegra X-15R）
流式细胞仪（BD Sciences，型号：LSRII）

程序

可以仅由公开的磷酸三酯组合成的不同21聚体siRNN的数量比宇宙中原子的数量多几个数量级（Meade等人，2014）。没有单个siRNN配置将是最有效的所有情况。应当确定构成siRNN的磷酸三酯组的最佳定位，类型和数目，用于??与特定递送或靶向结构域缀合并递送到靶细胞或组织中。在该方案中，我们集中于如Meade等人所述的具有TAT递送结构域（DD）肽的双链体siRNN寡核苷酸的缀合，纯化和细胞递送。 2014）（图2）。

siRNN共轭和纯化
1. 在1.5ml微量离心管中在50％ACN/50％超纯水（注2）中设置以下缀合反应：
  1. 1x siRNN共轭缓冲区
  2. 5.25M乙酸
  3. 50 uM siRNN ^A4
  4. 1 mM DD-Hynic肽（注3）
2. 在室温下孵育反应1小时（注4）。
3. 1小时后，将共轭溶液在碎干冰中冷冻
4. 冻干冻结的共轭溶液直至干燥（注释5）
5. 一旦干燥，通过移液将冻干颗粒溶解在500μl超纯水中
6. 将500μl粗DD-siRNN缀合物装入具有Ultracel-30膜的Amicon Ultra 0.5ml离心过滤装置中。
7. 将填充的过滤器单元以14,000×g离心5分钟。
8. 丢弃流通。
9. 在过滤器单元和移液器中的剩余液体中加入450μl超纯水混合
10. 重复步骤A7-9两次以上。
11. 将填充的过滤器单元在14,000×g离心10分钟。
12. 将过滤器单元倒入新鲜的收集管和离心机中在1,000×g下洗脱2分钟以洗脱纯化的DD-siRNN缀合物
13. 在紫外分光光度计上测量纯化的DD-siRNN缀合物在260nm的吸光度
14. 测定纯化的DD-siRNN缀合物的浓度使用在260nm测量的吸光度和双重的siRNN摩尔消光系数（注6和7）。
15. 稀释纯化 DD-siRNN缀合物与超纯水混合至所需浓度。将DD-siRNN缀合物储存在-20°C（注8）。
DD-siRNN共轭分析
1. 购买或浇铸1.5 mm 0.4％SDS 10％聚丙烯酰胺非变性凝胶，带10或??15孔梳子（注9）。
2. 等分0.1 nmol纯化的DD-siRNN共轭物，在新鲜的微量离心管中进行分析（注10）。
3. 在粉碎的干冰上冻结样品，冻干至干燥（注释11和12）
4. 一旦干燥，通过移液（注13）将冻干样品溶解在5μl的1x 0.4％SDS非变性加载缓冲液中。
5. 将聚合凝胶放入凝胶运行装置中并填充 0.4％SDS-PAGE电泳缓冲液。轻轻地从凝胶和通过强力吸取运行缓冲液清除孔空井
6. 将溶解在加样缓冲液中的样品装载到孔中的凝胶并在200V恒定下运行30分钟或直到染料前沿跑掉凝胶。
7. 一旦凝胶完成运行，仔细分离玻璃盒并除去凝胶。将凝胶沉积在小盘染色。
8. 用去离子水冲洗凝胶数次以去除运行缓冲液（注14）
9. 向染色皿中加入50-100ml去离子水并孵育凝胶在室温下摇动20分钟（注15）
10. 弃去洗涤液，用去离子水冲洗凝胶。
11. 按照SilverQuest Silver中所述进行银色染色 "基本染色方案"下的染色试剂盒协议（注16和17）
12. 在凝胶上图像银染色的凝胶以确定样品的缀合度和纯度（图2B）。
DD-siRNN细胞转导和分析
1. 在所需培养基中培养细胞。对于该方案，H1299细胞稳定 ?表达不稳定的EGFP（H1299-dGFP）葡萄糖DMEM培养基，补充有5％FBS和青霉素 - 链霉素 ?在37℃，5％CO 2下
2. 冲洗H1299细胞在PBS，胰蛋白酶H1299 细胞与0.05％胰蛋白酶-EDTA 5分钟，添加生长培养基，并温和用移液管向上和向下移动以从培养皿中分离细胞
3. 在台式离心机中以200×g离心细胞5分钟。
4. 弃去上清液，在Opti-MEM中漂洗细胞，并在200×g离心细胞5分钟。
5. 重悬细胞在新鲜的Opti-MEM中，并用Opti-MEM稀释细胞至5×10 5个细胞/ml。
6. 对于每个细胞处理，稀释DD-siRNN缀合物在150μl 新鲜Opti-MEM（推荐终浓度为50-500 nM）。转让将150μlDD-siRNN稀释液置于24孔细胞培养物的新鲜孔中板
7. 向孔中加入150μlH1299细胞（5×10 5个细胞/ml）含有稀释的DD-siRNNs，最终浓度为75,000 细胞/孔。通过小心地上下吹打数次混合。
8. 在37℃，5％CO 2孵育转导2小时
9. 在转导时间结束时，吸出治疗介质并用培养基更换（注18）
10. 24小时后，胰蛋白酶处理转导的细胞并分成三份相等部分。使用两部分种子新鲜24孔板以后分析48和72小时的时间点
11. 在流式细胞仪上分析细胞的最终部分以测量siRNN诱导的GFP的敲低（图3A-B）（注19）。
  014）。没有单个siRNN配置将是最有效的情况。磷酸三酯的最佳定位，类型和数量 ?应确定组成siRNN的基团以与a缀合特定的递送或靶向结构域和递送到靶细胞中或组织。在这个协议，我们专注于共轭，纯化，和 ?用TAT细胞递送双链体siRNNA4寡核苷酸交付域（DD）肽，如Meade等人（2014年） ?2）。

代表数据

图1.用于RNAi的细胞递送的siRibo核中性（siRNNs）。带有带电荷的磷酸二酯骨架的siRNA不能穿过细胞膜而无帮助。 siRNNs特征在于生物可逆磷酸三酯，其中和磷酸二酯骨架负电荷以允许通过TAT PTD递送结构域肽的细胞递送和诱导RNAi应答。资料来源：S.F. Dowdy实验室，UCSD。

图2.siRNN结构和与递送结构域（DD）肽的缀合。A.本方案中使用的磷酸三酯基团的结构。含有肼基的DD肽通过化学反应性A-SATE磷酸三酯基团与siRNNs缀合。通过细胞质硫酯酶切割DD-A-SATE除去磷酸三酯基团和缀合肽。 B.DD肽与含有一个，两个或三个A-SATE磷酸三酯基团的RNN寡核苷酸的缀合。通过SDS-PAGE分离样品，并如本方案中所述进行条染色。资料来源：S.F. Dowdy实验室，UCSD。

图3.DD-siRNN细胞转导 A. H1299-dGFP细胞在用自体递送GFP DD-siRNNA4或非靶向对照DD-siRNNA4处理48小时后的剂量曲线。 B.用GFP或对照DD-siRNNA4缀合物处理48小时后，通过流式细胞术分析H1299-dGFP细胞的直方图。如本文所述，在用靶向DD-siRNN缀合物成功转导后，整个群体经历RNAi应答。资料来源：S.F. Dowdy实验室，UCSD。

笔记

本方案中使用的DD肽（3T3S-Hy）是现场合成的，但可以从具有定制肽合成服务的各种供应商订购。
该配方针对带正电荷的DD肽与siRNN的缀合而优化，并且可能需要调节以与其他分子缀合。
因为每个siRNN A4分子中有4个醛A-SATE磷酸三酯基团，这导致DD肽与A-SATE的比例为5:1。
对于大于250μl的反应体积，在旋转式烤架上进行该反应是有利的
重要的是将缀合溶液冻干直至完全干燥，因为残留的乙酸和ACN可以使离心过滤膜变形，从而防止DD-siRNN缀合物的纯化。冻干样品所需的时间取决于所使用的设备。使用本方案中列出的设备，在真空压力为200mTorr和冷凝器温度为-80℃下，可以预期50μl/h的冻干速率。
使用Beer-Lambert定律计算纯化的DD-siRNN缀合物的浓度。 Beer-Lambert定律：A =εlc其中A是吸光度（在这种情况下在260nm）的测量，ε是摩尔消光系数，l是路径长度（对于大多数分光光度计为1cm），c是浓度的溶液。
双链寡核苷酸的摩尔消光系数应该根据经验确定。 292,500（M <= sup-1 ^-1）是本方案中使用的GFP siRNN的摩尔消光系数。
20μM是用于稀释用于24孔板处理的DD-siRNN缀合物的有用浓度。
如果铸造自己的凝胶，在50毫升锥形管中制备0.4％SDS非变性聚丙烯酰胺凝胶溶液。向凝胶溶液中加入200μl的10％过硫酸铵和800μl的10％SDS溶液。混合通过倒置管几次。添加20微升TEMED到凝胶溶液，倒置管数次混合。用凝胶溶液和玻璃板浇铸两个1.5mm凝胶。小心地插入凝胶梳，而不引入或捕获任何气泡。让凝胶在室温下放置20分钟，以确保在使用前完全聚合
如果DD-siRNN缀合物稀释至20μM，应分装5μl（0.1 nmol）用于分析。
干冰非常冷（-78.5℃）。始终小心处理干冰，并佩戴适当的个人防护装备（护目镜和绝缘手套）。
冻干时间将取决于设备和体积，但30分钟应足以完全干燥溶解在水中的5μlDD-siRNN缀合物。
不要加热DD-siRNN缀合物，因为这可能导致siRNN双链体熔化。一旦与DD肽缀合，单链RNN（ssRNN）将不容易复制
在该方案中使用12×10×3cm的聚丙烯培养皿进行染色
此步骤通过从凝胶中洗去一些SDS而减少银染期间的背景染色
SilverQuest银染试剂盒手册建议所有溶液使用100毫升，但可以使用50毫升，只要染色皿足够小，50毫升完全覆盖凝胶。
如果加载0.1nmol的DD-siRNN缀合物，则1-5分钟的银染色显影时间应足以显现缀合物。
在这些条件下，H1299细胞在2小时后将粘附在平板上。如果细胞不足以完全吸引转导培养基，加入500μl培养基，孵育板直至细胞粘附，然后吸出所有培养基。
对于该方案，在LSR II流式细胞仪上分析H1299-dGFP细胞。使用488nm激光和530/30发射滤光片测量dGFP。根据前向散射（FSC-A）和侧向散射（SSC-A）收集和门控5×10 4次事件。
本方案中使用的缩写：siRNA =短干扰RNA，PTD =肽转导结构域，siRNN = siRibo核酸中性，DMB =二甲基丁基，SATE = S-酰基-2-硫代乙基，HyNic = 6-肼基烟酰胺。

食谱

5xsiRNN偶联缓冲液（1ml） 500μl乙腈
315.5μl超纯水
9.5μl10.5M苯胺（100mM终浓度）
125μl200mM HEPES（pH5.5）（25mM终浓度） 50μl5M NaCl（250mM终浓度）
0.4％SDS非变性聚丙烯酰胺凝胶溶液 12.2ml超纯水
5ml 40％丙烯酰胺/双溶液
2 ml 10x TBE
0.4％SDS-PAGE电泳缓冲液（1L） 40ml 10％SDS溶液
100ml 10×TBE
860ml去离子水
1x 0.4％SDS非变性上样缓冲液（1ml） 40μl10％SDS溶液
250微升甘油 2 mg橙色G
将超纯水加入1 ml

致谢

本文所述的方案是先前在Meade等人（2014）中开发和利用的。 A.S.H。得到T32癌症生物学培训资助（NCI）和来自圣地亚哥基金会的Blasker奖的支持。这项工作得到了W.M. Keck基金会（S.F.D.），国防部（S.F.D.），来自白血病&淋巴瘤协会（S.F.D.），Pardee基金会（S.F.D.），来自匿名捐赠者（S.F.D.）和霍华德休斯医学研究所（S.F.D.）的赠款。
作者声明竞争的经济利益。 S.F.D和K.G. （UCSD）已经提交了由Solstice Biologics，Inc.（圣地亚哥）许可的这项工作的专利。 S.F.D.是Solstice Biologics的共同创办人。 S.F.D.是Solstice Biologics的董事会主席。

参考文献

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Farkhani，S.M.，Valizadeh，A.，Karami，H.，Mohammadi，S.，Sohrabi，N.and Badrzadeh，F。细胞穿透肽：用于递送纳米颗粒，纳米载体，治疗和诊断分子的高效载体。 Peptides 57：78-94
Meade，B.R。和Dowdy，S.F。（2007）。使用肽转导结构域/细胞穿透肽的外源性siRNA递送。 Deliv Rev 59（2-3）：134-140
Meade，BR，Gogoi，K.，Hamil，AS，Palm-Apergi，C.，van den Berg，A.，Hagopian，JC，Springer，AD，Eguchi，A.，Kacsinta，AD，Dowdy，CF，Presente， A.，Lonn，P.，Kaulich，M.，Yoshioka，N.，Gros，E.，Cui，XS和Dowdy，SF（2014）。含有可逆电荷中和磷酸三酯骨架修饰的RNAi前药的有效递送。 Nat Biotechnol 32（12）：1256-1261。