材料和试剂

组织培养皿（60×15mm）（Sigma-Aldrich，目录号：P5237）
组织培养皿（100×20mm）（Nunc，目录号：172958）
螺旋盖离心管（50ml）（Sigma-Aldrich，目录号：BR114821）
24孔板（Sigma-Aldrich，目录号：CLS3527）
移液管吸头（10μl，200μl和1000μl）（Shineteh instruments co ltd。，目录号：PT4-W10，PT1-Y200和PT5-W10）
新生的Sprague-Dawley幼仔（1日龄）
台盼蓝（Thermo Fisher Scientific，GibcoTM，目录号：15250061）
Hanks平衡盐溶液（HBSS）（Sigma-Aldrich，目录号：55021C）
碳酸氢钠（Sigma-Aldrich，目录号：S5761）
丙酮酸（Sigma-Aldrich，目录号：P2256）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A9418）
DMED粉末（Thermo Fisher Scientific，GibcoTM，目录号：12100-046）
DMED/F-12，HEPES，无酚红（Thermo Fisher Scientific，GibcoTM，目录号：11039-021）
青霉素/链霉素（100x）（Thermo Fisher Scientific，GibcoTM，目录号：15140-122）
100mM丙酮酸钠溶液（100x）（Thermo Fisher Scientific，GibcoTM，目录号：11360-070）
MEM非必需氨基酸溶液（100x）（Thermo Fisher Scientific，GibcoTM，目录号：11140-050）
胎牛血清（FBS）（NQBB，目录号：A6806-11）
汉克的解决方案（见配方）
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（参见Recipes）
无血清培养基（100ml）（见配方）

设备

37℃，5％CO 2培养箱（水夹套实验室CO 2培养箱）中。
立体显微镜（Shineteh instruments co。，目录号：IH1-ZM150A）
生物反转显微镜（OLYMPUS CORPORATION，型号：IX71）
微型离心机（Shineteh instruments co。，目录号：IC-MINIMAX）
离心机（Hermle，目录号：Hermle Z232K）
水浴（Bioman Scientific Co ltd，目录号：SWB-20-1）
计数室（Shineteh instruments co。，目录号：PT14-901001）
操作剪STR（Shineteh instruments co。，目录号：ST-014）
虹膜剪STR（Shineteh instruments co。，目录号：ST-S009）
敷料钳（Shineteh instruments co。，目录号：ST-D114）
Iris镊子（Shineteh instruments co。，目录号：ST-I510）
镊子钳（Shineteh instruments co ltd。，目录号：ST-NO5）
Pipetman（Gilson，目录号：P10，P200和P1000）
移液管（Thomas Scientific，FlaconTM，目录号：0410C04）
吸管（10ml）（Tseng Hsiang Life Science有限公司，目录号：SP-1-C）
冰桶（Shineteh instruments co ltd。，目录号：PA8-4）

程序

原代神经元胶质细胞培养物从1日龄新生儿Sprague-Dawley幼鼠的皮质组织制备。
在处死大鼠后，无菌地快速除去其大脑。在立体外科显微镜下，用镊子除去血管和脑膜
在无菌条件下解剖大脑皮质（6?8只大脑皮层/管），并保持在冰上在含有10ml Hank's溶液（不含Ca 2+或Mg 2+）/sup>）。
取出Hank's溶液，并加入15ml含有10％热灭活的FBS的温热（37℃）Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）至50ml锥形管。
使用10ml移液管通过研磨使皮层细胞解离（约15次）。将细胞在4℃（1,500xg）离心5分钟以沉淀细胞。
离心后，将细胞重悬于10ml含有10％热灭活的FBS的DMEM中。
通过将20μl细胞加入到180μl培养基（10倍稀释）中稀释细胞用于计数。
加入10μl的上述细胞稀释液到血细胞计数器。细胞在1mm中心正方形中计数。
细胞密度由5个随机选择的正方形的平均值确定。为了计算总细胞数/ml =（每平方的平均计数）×（稀释因子）×（10 /ml）。
稀释10ml原液，使最终浓度为5×10 5细胞/ml。
向24孔培养板的每个孔中，将5×10 5个细胞接种在0.5ml培养基中。
将培养物在37℃下在5％CO 2和95％空气的湿润气氛中孵育。
培养基在铺板后5天补充，然后每三天更换一次
电镀后10-12天神经元胶质细胞变成融合
体外14天（DIV14），将培养物用于实验。通过免疫染色，然后通过细胞计数测定细胞组成。神经胶质细胞培养物由约37％±0.8％神经元，51％±1.5％星形胶质细胞和7％±7.7％小胶质细胞组成（图1）。此外，培养物还包括少量（<5％）的其他细胞，包括少突胶质细胞，成纤维细胞和内皮细胞（数据未显示）。
神经元表型的表征如图2所示

图1.原代皮层神经元胶质细胞培养物中细胞类型的组成。原代皮质神经胶质细胞培养物的体外显微镜照片（DIV14）（a），和使用抗（神经元）树突标记微管相关蛋白2（MAP2）（b），星形细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）（c）或泛巨噬细胞溶酶体抗原（ED1）作为吞噬标记的抗体的代表性免疫细胞化学染色的显微照片对于活化的小胶质细胞（d）。培养物中神经元（MAP2 + +），星形胶质细胞（GFAP +）和活化的小胶质细胞（ED1 +）的免疫染色阳性细胞的百分比）。比例尺=25μm

图2.通过免疫细胞化学染色表征神经元表型。使用针对（a）神经元标记神经元核抗原（NeuN）的抗体在14天体外染色培养物（DIV 14 ），（b）谷氨酸能神经元的兴奋性氨基酸载体1（EAAC1），（c）5-羟色胺能神经元的5-羟色胺（5HT），（d）GABA能神经元的谷氨酸脱羧酶65（GAD 65），（e）胆碱乙酰转移酶ChAT）和（f）儿茶酚胺能神经元的酪氨酸羟化酶（TH）。比例尺=25μm

食谱

汉克氏溶液（1000ml）

试剂
卷

汉克斯平衡盐溶液
1000 ml

碳酸氢钠
0.35克

丙酮酸
0.11克

HEPES
4.76克

牛血清白蛋白（BSA）
3克
10％胎牛血清（FBS）/Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（1000ml）中培养。

试剂
卷

DMED粉末
1包

碳酸氢钠
2.2 g

丙酮酸
0.11克

HEPES
4.76克

FBS
110 ml
无血清培养基（100 ml）（仅药物治疗）

试剂
卷

DMED/F-12，HEPES，无酚红
97 ml

100x青霉素/链霉素 1 ml

100x丙酮酸钠溶液（100mM） 1 ml

100x MEM非必需氨基酸溶液
1 ml

致谢

该协议改编自先前公开的研究（Huang等人，2015; Huang等人，2014; Huang等人， 2009; Kim 等人，2000）。这些研究部分来自新生医学保健和管理学院（HSC-103-001和HSC-104-015）和台北医科大学（03C0720004A）到YNH的资助;和来自科技部（MOST-104-2923-B-038-001-MY3和MOST-104-2320-B-038-057-MY3）至台湾的JYW。

参考文献

Hirsch，E.C。和Hunot，S。（2009）。帕金森病中的神经炎症：神经保护的靶点 Lancet Neurol < em> 8（4）：382-397。
Huang，Y. N.，Ho，Y. J.，Lai，C. C.，Chiu，C.T.and Wang，J.Y。（2015）。 1,25-二羟基维生素D3通过抑制原代皮层中的MAPK激活而减弱内毒素诱导的炎症介质的产生神经元胶质细胞培养物。 12：147
Huang，Y. N.，Lai，C. C.，Chiu，C. T.，Lin，J. J.和Wang，J. Y.（2014）。 L-抗坏血酸通过抑制MAPK激活和NF-kappaB易位减弱内毒素诱导的炎症介质的产生in cortical neurons/glia Cocultures。 PLoS One 9（7）：e97276。
Huang，Y.N.，Wang，J.Y.，Lee，C.T.，Lin，C.H.，Lai，C.C.and Wang，J.Y。 L-抗坏血酸通过增强内源性血红素加氧酶-1的诱导而减弱甲基苯丙胺神经毒性。 "毒理学和应用药理学"265（2）：241-252。
Huang，Y.N.，Wu，C.H.，Lin，T.C.and Wang，J.Y。（2009）。甲基苯丙胺在皮层神经元和神经胶质中诱导血红素加氧酶-1表达，以预防其毒性。 "毒理学和应用药理学"240（3）：315-326。
Kim，W.G.，Mohney，R.P.，Wilson，B.，Jeohn，G.H.，Liu，B。和Hong，J.S。（2000）。对大鼠脑中脂多糖诱导的神经毒性的易感性的区域差异：小胶质细胞的作用。?? J Neurosci 20（16）：6309-6316。
Lee，Y.，Lee，S.R.，Choi，S.S.，Yeo，H.G.，Chang，K.T.and Lee，H.J。（2014）。治疗性靶向急性缺血性卒中后的神经炎症和小胶质细胞。 /em> 2014：297241.
Minghetti，L。（2005）。炎症在神经变性疾病中的作用 Curr Opin Neurol 18（3）：315-321。