材料和试剂

材料
1. Sterilin ^TM标准90mm培养皿（Thermo Fisher Scientific，目录号：101/IRR）
2. 微测试板96孔，F（SARSTEDT AG& Co，目录号：82.1581.501）
3. 1.5 ml Eppendorf管
4. 带有格栅的方形培养皿（120mm×120mm）（Greiner Bio-One GmbH，目录号：688102）
5. 毛细管（Sigma-Aldrich，Drummond Microcaps ，目录号：P1424）
6. 巴斯德吸管灯泡
7. 锥形瓶100ml
菌株
1. p。铜绿假单胞菌PAO1（Stover等人，2000）
2. E。大肠杆菌HD49（Reyes-Darias等人，2015a），无化学感受器菌株E。大肠杆菌UU1250（Amers等人，2002），其携带编码包含Pct的PctC化学感受器的LBD的嵌合受体的质粒。铜绿假单胞菌PAO1（Taguchi等人，1997; Rico-Jimenez等人，2013）和E的MA结构域。大肠杆菌 Tar受体
试剂
1. HEPES钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：H7006）
2. 磷酸氢二钾（HK2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P3786）
3. 水杨酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：S3007）
4. 氯霉素（Sigma-Aldrich，目录号：C-0378）
5. 磷酸二氢钾（H 2 KPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：60220）
6. 硫酸铵[（NH 4）2 SO 4]（Merck Millipore Corporation，目录号：1.01217）
7. 柠檬酸三钠二水合物（Sigma-Aldrich，目录号：C7254）
8. 硫酸镁七水合物（MgSO 4·7H 2 O 7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：63140）
9. 盐酸硫胺素（盐酸硫胺素）（Sigma-Aldrich，目录号：47858）
10. 甘油（Scharlab，S.L.，目录号：GL0027005P）
11. L-苏氨酸（Sigma-Aldrich，Fluka，目录号：89179）
12. L-甲硫氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：M9625）
13. L-亮氨酸（Merck Millipore Corporation，目录号：5360）
  注意：目前，它是"默克密理博公司，目录号： 105360 "。
14. L-组氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：153688）
15. γ-氨基丁酸（GABA）（Sigma-Aldrich，目录号：A2129）
16. Bacto-Agar（BD，Difco ^TM，目录号：281230）
17. 氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
18. 胰蛋白胨肉汤（TB）培养基（见配方）
19. 0.9％NaCl溶液（见配方）
20. LB介质（见配方）
21. 5x最小A盐（见配方）
22. 5 mg/ml氨基酸混合物（见配方）
23. 最小梯度板介质（见配方）

设备

分光光度计（Perkin Elmer，型号：uv /visλ20）
孵育器（30℃和37℃）（Thermo Fisher Scientific，Heraeus，型号：B6060培养箱）
轨道摇床孵化器SH maxi（ControltécnicaInstruments）
离心机Allegra X-22R（Beckman Coulter）
pH计GLP22（HACH LANGE SPAIN，Crison）
本生灶
两对镊子
灯泡分配器（Drummond Scientific Company，目录号：1-000-9000）

程序

在本出版物的第一部分中，我们将描述定量毛细管测定，其中使用对 g span> -aminobutyrate（GABA）。这些实验已经显示出P.铜绿假单胞菌PAO1显示GABA趋化性，并且该反应由PctC化学感受器介导（Reyes-Darias等人，2015a）。为了更详细地表征PctC化学受体，我们产生了嵌合受体（图1），其进一步详细报道（Reyes-Darias等人，2015a）。现在有大量的信息显示不同的受体嵌合构建体是功能性的（Feng等人，1997; Krikos等人，1985; Kristich等人2003; Repik等人，2000; Reyes-Darias等人，2015a; Reyes-Darias等人，2003; ，2015b; Weerasuriya等人，1998）。
在该出版物的第二部分中，我们将描述对无化学感受器应变的实例的梯度板趋化性测定。其中导入了编码PctC-Tar嵌合体的构建体的大肠杆菌UU1250。这种方法是通过体内实验确定化学效应子谱的方便手段。

图1.PctC-Tar嵌合受体的构建。 Tm：跨膜区; LBD：配体结合结构域; HAMP接头结构域（存在于组氨酸激酶，腺苷酸环化酶，甲基接受蛋白和磷酸酶中）是约50个氨基酸的α-螺旋区; MA：甲基受体结构域;图的修改版本（Reyes-Darias等人，2015a）。

定量毛细管趋化性测定

该测定法的原理包括将化学感受器填充的毛细血管浸入细菌悬浮液中。在趋化性的情况下，细胞将优先游进毛细管，而在化学打印的情况下，与缓冲液填充的对照毛细管相比，更少的细胞将游入毛细管。然后清空毛细管，并确定菌落形成单位的数量。我们在这里详述由Adler（1973）开发的原始毛细管测定法的修改版本。

p。铜绿假单胞菌PAO1在旋转振荡器上在200rpm和37℃下在LB培养基（pH = 7.4）中生长过夜（12-18小时）。
随后将0.1-0.2ml过夜培养物转移到100ml的Erlenmeyer烧瓶中的20ml新鲜LB培养基（pH = 7.4）中。初始OD <600> 应在0.05-0.07之间
在37℃和200rpm下培养物生长至早期的固定相（OD <600）0.25-0.35。
然后必须将细胞改变为用于迁移和趋化性的适当培养基。通过在1,667×g（4℃）离心5分钟用4ml趋化性缓冲液（HEPES，pH = 7.0）洗涤4ml培养物两次，然后将细胞沉淀重悬浮至密度OD 600 = 0.04-0.05在4-8ml趋化缓冲液中。严酷的细胞治疗可能导致鞭毛的损失。
随后，将230μl等分的细菌悬浮液置于96孔板的孔中。
毛细管在一端热密封在燃烧器的火焰上（图2A）。然后将开放端插入化学引诱物溶液（图2B），其pH已经调节至对于细菌悬浮液（pH = 7.0）测量的。作为阴性对照，用趋化缓冲液填充毛细血管，对于阳性对照，用已知的强化学引诱物填充毛细血管，在假单胞菌菌株的情况下，用0.1％酪蛋白氨基酸填充。将毛细管的封闭端插入橡胶适配器中，然后将其放置在孔上，使得毛细管的开口端浸入细菌悬浮液中（图2C）。
孵育30分钟后，从平板上除去毛细管，并用水冲洗与细菌接触的毛细管部分。毛细管的密封端破碎，并使用球形分配器将其内容物倒入含有1ml 0.9％（w/v）NaCl溶液的微量离心管中（图2D）。

图2.毛细管测定的实验设置 A.毛细管的一端在明火密封。 B.将密封并加温的毛细管插入化学引诱物溶液中用于填充。 C.将具有毛细管的橡胶适配器放置在孔上，其将毛细管的开口端浸入先前已置于孔中的细菌悬浮液中。 D.将毛细管内容物倒入含有0.9％（w/v）NaCl的Eppendorf管中

在短暂离心（5-10秒）后，在0.9％（w/v）NaCl中制备所得细胞悬浮液的系列10倍稀释液。对于细胞计数，使用（Hoben和Somasegaran，1982）中描述的方案的修改版本。将含有补充有17.5μg/ml氯霉素的LB培养基（pH = 7.4）的琼脂平板分成六个扇区，将三个单独的20μl等分试样放置在如图3所示的平板扇区上。
将板在37℃下孵育20-24小时，然后进行细胞计数

图3.含有氯霉素的LB琼脂平板，用于定量毛细管趋化性测定中的细胞计数。铜绿色PAO1菌落从缓冲液对照（左）和趋化性趋向于1mM GABA（右）。显示10倍稀释，并且进一步稀释是精确定量GABA趋化性实验的菌落所必需的。

第二部分。梯度板测定

在该测定中，将化学效应子的等分试样沉积在琼脂板上。在温育允许化学效应物梯度形成之后，将细菌悬浮液的等分试样放置在距沉积的化学效应器的限定距离处。约后。 1天，检查板。在化学吸引的情况下，细菌卤素朝向化学效应器是非中心的，在化学打印的情况下，卤素远离化学效应子。

用80ml Minimal A梯度板培养基（pH = 7）填充带有通气孔的方形培养皿（120mm×120mm）（参见注释1）。将板在室温下冷却至少3小时。移动板时必须小心，因为琼脂是半固体的并且容易损坏
沿着板的垂直中心线，将10μl等分试样的溶解于无菌水中的浓缩化学作用物溶液（在所示的情况下，10mM GABA，参见注释2）以规则的距离放置（图4）。将平板在4℃孵育12-16小时以形成梯度
细菌，在所示的情况下。大肠杆菌HD49在补充有17.5μg/ml氯霉素的TB培养基中于30℃生长过夜。
然后通过在4℃下以1,667×g连续离心5分钟并重悬浮，用1ml的0.9％（w/v）NaCl洗涤1ml的细胞培养物两次。然后将细胞悬浮液用0.9％（w/v）NaCl稀释至OD 600为0.4-0.6。
最初，将2微升等分的细菌悬浮液水平放置到每个化学引诱剂点，但与化学引诱物沉积物的距离为0.5-3.5cm（图4）。将平板在30℃孵育16-30小时。然后将趋化性被最佳地看到的距离用于进一步分析。通常，细胞可以沉积在引诱剂的任一侧，这是产生重复测量或评估针对相同化学效应物沉积物的不同菌株（wt和突变株）的出血的方式。
从这些平板中，通过计算如（Pham和Parkinson，2011）所述的反应指数，可以半定量的方式测定趋化性的大小。简言之，使用RI = D1 /（D1 + D2），确定从接种位点到最接近（D1）和距离（D2）化学引诱源最远的菌落边缘的距离，以计算响应指数（RI）。 RI高于0.52表示趋化性，而低于0.48的RI表示化学打印。 0.48和0.52之间的RI值表示中性行为。

图4.梯度板测定的实验装置

代表数据

图5显示了来自P的定量毛细管测定的结果。铜绿假单胞菌PAO1，其突变体缺乏在pctC 化学感受器中，突变体用携带针对GABA的mcpG 基因的质粒补充。数据用游泳到含有毛细管的缓冲液中的细胞数量校正，并表示为迁移到含有GABA的毛细管中的细菌细胞。

图5.野生型，突变体和互补的突变株p的定量毛细管趋化性测定。铜绿假单胞菌 PAO1到GABA。这个数字取自Rico-Jimenez等人（2013）。

图6显示了针对E的GABA的梯度板测定。含有Tar受体或PctC-Tar嵌合体作为唯一化学感受器的大肠杆菌菌株。在Tar??的情况下，细菌晕是圆形的，因此确定RI为0.50，表明不存在趋化性。在PctC-Tar实验中，光晕对于沉积的GABA是偏心的，并且衍生的RI为0.88表示强的趋化性。

图6. 的梯度板测定 E。大肠杆菌表示Tar（顶部）或PctC-Tar（下）作为化学感受器。显示重复样本。 Tar的响应指数为0.5（±0.05），PctC-Tar的响应指数为0.88（±0.02）。一个数字的修改版本取自Reyes-Darias等人。（2015a）。

笔记

该板含有1μM水杨酸钠诱导嵌合受体的表达和17.5μg/ml氯霉素以选择质粒维持。
梯度板测定中的最佳引诱剂浓度变化。可以进行具有不同浓度的化学效应沉积物的初始实验（1至100mM）。通常，用10mM溶液观察到良好的反应，并且细菌和化学作用物之间的距离为2.5cm
使用超纯水（通过纯化去离子水以在25℃下获得18MΩcm的灵敏度）和分析级试剂制备所有溶液。

食谱

注意：使用超纯水（通过纯化去离子水以在25℃下获得18MΩcm的灵敏度）和分析级试剂制备所有溶液。

胰蛋白胨肉汤（TB）培养基
10g胰蛋白胨
5克NaCl
将dH <2> O添加至1,000 ml
高压灭菌并在室温下贮存
0.9％NaCl溶液
9克NaCl 将dH <2> O添加至1,000 ml
高压灭菌并在室温下贮存
Luria-Bertani（LB）培养基
5g酵母提取物
10克胰蛋白胨肉汤培养基
5克NaCl
将dH <2> O添加至1,000 ml
将pH调节至7.4
高压灭菌并在室温下贮存
5x最小A盐
26.25克K sub 2 HPO 4
11.25g KH 2 PO 4 sub/
2.5g（NH 4）2 SO 4>/
1.25克柠檬酸钠将dH <2> O添加到500ml
高压灭菌并在室温下贮存
5mg/ml氨基酸混合物
250毫克L-苏氨酸 250mg L-组氨酸 250毫克L-甲硫氨酸 250毫克L-亮氨酸 dH 2 O至50ml ml 过滤并储存在4℃下
最小梯度平板培养基
1×最小A盐
0.2％（v/v）甘油 1mM MgSO 4。7H 2 O 3 0.04mg/ml氨基酸混合物
0.1mg/ml硫胺素 0.25％（w/v）琼脂 dH 2 O至100毫升
将pH调节至7
将梯度板在室温下固化2-4小时

致谢

这项工作得到了FEDER基金和Fondo社会Europeo通过拨款从安达卢西亚Junta（拨款P09-RNM-4509和CVI-7335到TK），西班牙经济和竞争力部（授予Bio2010-16937 TK）和EMBO短期奖学金资助ASTF 479 -2012 to JA-R。

参考文献

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Stover，CK，Pham，XQ，Erwin，AL，Mizoguchi，SD，Warrener，P.，Hickey，MJ，Brinkman，FS，Hufnagle，WO，Kowalik，DJ，Lagrou，M.，Garber，RL，Goltry，，Tolentino，E.，Westbrock-Wadman，S.，Yuan，Y.，Brody，LL，Coulter，SN，Folger，KR，Kas，A.，Larbig，K.，Lim，R.，Smith， Spencer，D.，Wong，GK，Wu，Z.，Paulsen，IT，Reizer，J.，Saier，MH，Hancock，RE，Lory，S.and Olson，MV（2000）。绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）的完整基因组序列 PAO1，一种机会性病原体。 a> 406（6799）：959-964。
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