材料和试剂

胶原包被的皿（Sanyo，IWAKI，目录号：4010-010）
透明PET膜24孔3.0μm孔径（Corning，Falcon ，目录号：353096）
24孔板用于细胞培养插入物（Corning，Falcon ，目录号：353504）。
剃刀刀片（Esbjerg，Feather，目录号：FA-10）
微滑玻璃（Matsunami Glass Ind，目录号：TF0215M）
微型玻璃，24×24mm（厚度NO.1：0.12-0.17mm）（Matsunami Glass Ind）
胃癌细胞（44As3）（Yanagihara K et al。，2005）
注意：它是由胃癌患者建立的。
成纤维细胞（CAF）（Fuyuhiro Y et al。，2011）
注意：它与胃癌患者的手术材料隔离。
I型胶原（Nitta Gelatin Inc.，Cellmatrix Type I-P）
Matrigel矩阵（Corning，目录号：356234）
（DiO）（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes TM，目录号：D-275）
1,1'-二（十八烷基）-3,3,3'，3'-四甲基吲哚 - 羰花青高氯酸盐（DiI）（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes TM，目录号：D-282）
胰蛋白酶-EDTA溶液（Sigma-Aldrich，目录号：T3924）
青霉素 - 链霉素（Sigma-Aldrich，目录号：P4333）
Dulbecco改良的Eagle培养基（Sigma-Aldrich，目录号：D6046）
RPMI-1640培养基（Sigma-Aldrich，目录号：R8758）
10x Dulbecco改良的Eagle培养基（Sigma-Aldrich，目录号：D2429）
10x RPMI-1640培养基（Sigma-Aldrich，目录号：R1145-500ML）
胎牛血清（热灭活）（Sigma life science，目录号：172012-500ML，批次：S13C490）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Sigma-Aldrich，目录号：P4417）
4％多聚甲醛磷酸盐缓冲液（Wako Pure Chemical Industries，目录号：163-20145）
聚乙烯醇封固剂（Sigma-Aldrich，Fluka，目录号：10981）
速溶胶（Krazy Glue，目录号：KG585）
NaHCO 3（Sigma-Aldrich，目录号：S6014-500G）
NaOH（Sigma-Aldrich，目录号：S5881-500G）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H7006-25G）
凝胶（0.2mg/ml I型胶原和2.5mg/ml基质胶基质）（参见Recipes）
重建缓冲区（请参阅配方）

设备

镊子（Electron Microscopy Sciences，Dumont，型号：5）
37℃，5％CO 2培养箱（LabX，Sanyo，型号：MCO-19AIC）中。
解剖显微镜（OLYMPUS CORPORATION，型号：SZ61）
光源（OLYMPUS CORPORATION，KL1600LED）
Vibratome（DOSAKA EM，型号：LinearSlicer PRO7）
共聚焦激光扫描显微镜（ZEISS，型号：LSM 780）

程序

44As3细胞和胃CAF在37℃下在含有5％CO 2的湿润气氛中在分别补充有10％FBS和青霉素（100单位/ml） - 链霉素（0.1mg/ml）的RPMI-1640培养基或DMEM中培养， sub> 2 。 CAF保持在胶原包被的皿中
44As3细胞和CAF分别用DiO或DiI标记，如下。在2.5mg/ml的二甲基甲酰胺中制备DiO和DiI的储备溶液。将DiO或DiI以6μg/ml的终浓度加入培养基中，并将细胞在CO 2培养箱中孵育1小时。然后通过用含有10％FBS的新鲜培养基替换来洗涤细胞，并且放回CO 2培养箱中20分钟，重复该步骤两个循环。
在标记细胞期间，制备凝胶。将含有0.2mg/ml I型胶原和2.5mg/ml基质胶基质的无血清DMEM/RPMI-1640（1:1）培养基置于转座上室（150μl/孔），并在CO 2培养箱中在37℃下固化30分钟。
通过胰蛋白酶-EDTA（胰蛋白酶0.5g/L，孵育3分钟）分离44As3细胞和CAF，并在200μl由1:1混合物的混合物组成的培养基中混合（各1.5×10 4个细胞） DMEM和补充有0.2％FBS的RPMI-1640，并置于凝胶上。 Transwell的下部室填充有700μl具有10％FBS的相同培养基。将细胞孵育5-9天，每隔一天更换上和下培养基（图1）

图1. transwell插入物中凝胶上的细胞培养（左）。将用可区分的荧光染料标记的癌细胞和成纤维细胞的混合物放在凝胶上，所述凝胶在3.0μm多孔的transwell插入物中制备。（对）。细胞根据血清梯度侵入凝胶
通过沿整个圆周切割插入膜片（视频1），从transwell插入物中取出凝胶。将凝胶在4％多聚甲醛中在室温下固定1小时，或在4℃下过夜。如果需要，拍摄整个凝胶作为活化的成纤维细胞收缩凝胶（图2A）。
固定的凝胶一次用PBS漂洗。在解剖显微镜下用剃刀刀片切下凝胶的周边（图2B）。切除通常通过标记的荧光可见的细胞区域的边缘。通过瞬间胶将凝胶附着在振动切片机的台上（图3A，B），并在PBS中切成200μm厚的切片（图3C-D，视频2）。

图2.在置于振动器上之前凝胶的外观。 A.从插入物取出并固定后的整个凝胶的外观。 B.切除凝胶的周边部分。切除的位置显示在底部。

图3.通过vibratome切片的凝胶。 A，B.将凝胶面朝下贴在vibratome的金属台上。 A.高级视图，B.凝胶的侧视图。该阶段充满PBS。将凝胶用PBS中的剃刀刀片切片。 D.显示切片的方向。
从PBS中取出切片，放在载玻片上，并且通过在解剖显微镜下用镊子矫正切片的形状来固定切片的形状。用纸擦拭多余的PBS，并安装在聚乙烯醇固定介质中（图4）

图4.切片凝胶的外观。 A.切片凝胶的图示。 B.将切片凝胶布置在载玻片上。 Bar = 1 mm
在固化封固介质后，使用共焦显微镜观察切片。 3D渲染的图像从z-stack图像获得（图5）。

图5.凝胶切片的代表性共聚焦图像。绿色：癌细胞，红色：CAF。癌症（44As3）细胞和CAF的混合物突出和侵入凝胶。凝胶在第7天固定。条=100μm

笔记

培养期的最佳长度应根据经验确定。通常在5-9天之间。如果固化的胶粘在切片的凝胶上，应该在解剖显微镜下安装前使用镊子在PBS中除去。

食谱

凝胶（0.2mg/mlI型胶原和2.5mg/ml基质胶基质）混合I型胶原凝胶和基质胶基质（3：1）。例如，如果你使总共800μl混合凝胶，首先通过混合10x浓度准备600μl的I型胶原。培养基（60μl），重建缓冲液（60μl）和I型胶原（480μl）。加入200μl基质胶基质并彻底混合
重建缓冲区
2.2g NaHCO 3在100ml 0.05N NaOH和200mM HEPES中的溶液

致谢

该方案改编自先前公开的研究，Satoyoshi等人（2015a; 2015b）和Tsuji等人（2015）。这项工作由JSPS KAKENHI（批准号25290042,26640068）和高松公主癌症研究基金研究基金（No.14-24620）支持。

参考文献

Fuyuhiro，Y.，Yashiro，M.，Noda，S.，Kashiwagi，S.，Matsuoka，J.，Doi，Y.，Kato，Y.，Hasegawa，T.，Sawada，T.and Hirakawa， 2011）。通过TGF-β从胃癌胃癌细胞上调癌相关肌成纤维细胞。 Br J Cancer 105（7）：996-1001。
Satoyoshi，R.，Kuriyama，S.，Aiba，N.，Yashiro，M.and Tanaka，M.（2015a）。 Asporin激活scirrhous胃癌和癌相关成纤维细胞的协调入侵。癌基因 34（5）：650-660。
Satoyoshi，R.，Aiba，N.，Yanagihara，K.，Yashiro，M.and Tanaka，M.（2015b）。在间皮细胞中的Tks5激活产生腹膜癌发生的侵袭。癌基因 34（24）：3176-3187。
Tsuji，T.，Satoyoshi，R.，Aiba，N.，Kubo，T.，Yanagihara，K.，Maeda，D.，Goto，A.，Ishikawa，K.，Yashiro，M.and Tanaka， 2015）。 Agr2介导旁分泌对基质成纤维细胞的作用，促进胃癌细胞癌侵袭 Cancer Res 75（2）：356-366。
Yanagihara，K.，Takigahira，M.，Tanaka，H.，Komatsu，T.，Fukumoto，H.，Koizumi，F.，Nishio，K.，Ochiya，T.，Ino，Y.and Hirohashi， 2005）。人类胃癌的腹膜转移小鼠模型的开发和生物分析 Cancer Sci 96（6）：323-332。