材料和试剂

培养皿（培养面积：56.7cm 2，直径：100mm）（Thermo Fisher Scientific，目录号：150350）
细胞过滤器（70μm）（VWR International，Greiner Bio-One GmbH，目录号：89508-344）
（图1B）用剪钳切割的夹子（Mitsuya，目录号：GM-590）
苯乙烯泡沫（RIKAKEN）（图1C）
50ml Falcon管（Corning，目录号：352070）
8-12周龄Lewis大鼠（Charles River Laboratories International）
胶原酶V（Wako Pure Chemical Industries，目录号：038-17851）
α-最小必需培养基（α-MEM）（Thermo Fisher Scientific，目录号：12561-056）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，目录号：12483-020）
链霉素，青霉素，两性霉素B（抗生素 - 抗真菌剂，100x）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15240-062）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：14190-235）
含有10％FBS和抗生素的α-MEM（参见配方）
3mg/ml胶原酶溶液（用于来自两膝关节的滑膜）（参见配方）

设备

37℃，5％CO 2强制空气培养箱（ASTEC，目录号：SCA-165DS）中。
离心机（KUBOTA Corporation，型号：8730型）
手术刀（Natsume，目录号：11D-13），剪刀（Natsume，目录号：B-12）和镊子（Natsume，：A-6）（图1A）

程序

手术准备（10分钟）
1. 通过在乙烯袋中输送CO 2来牺牲老鼠。
2. 取出膝关节周围的头发，用70％乙醇无菌清洁腿（图1D）
3. 把大鼠放在苯乙烯泡沫，并覆盖在大鼠的无菌板，保持右腿出洞。用苯乙烯泡沫上的夹子稳定踝部（图1E）。
  
  图1.手术准备 A.外科器械; B.用于稳定腿的夹子; C.苯乙烯形式; D.去除头发; E.腿的设置。
从膝关节收获滑膜（视频1）（两个膝关节10分钟）
1. 暴露髌腱与直皮肤切口。
2. 切割髌腱横向，并向上和向下剥离腱暴露下髌骨脂肪垫。
3. 从股骨和胫骨分离髌下脂肪垫。
4. 将滑膜置于Falcon管中的PBS中。
  
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  视频1.从右膝收获包括髌骨下脂肪垫的滑膜
  
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滑膜MSC的分离和培养
1. 用刮刀将滑膜切成2-3毫米的块
2. 将切碎的滑膜置于胶原酶溶液中
3. 将管在孵化器中2-3小时。每小时摇动2-3次。
4. 通过细胞过滤器过滤消化的溶液。
5. 以580×g离心管5分钟。
6. 除去上清液，将细胞平铺在56.7cm 2培养皿（约1,000细胞/cm 2 ）上。
7. 每周更换培养基两次，用含有10％FBS和抗生素的α-MEM培养2周

代表数据

我们通常可以从一个滑膜收获1×10 4个细胞（图2）。 2周后，我们可以从一个培养皿中获得5×10 5个<1> 1×10 6个 MSCs。细胞是异质的，我们通常在实验中使用2-4代的这些细胞。我们在之前的报告中报告了这些数据（Yoshimura等人，2007年）。

图2.滑膜MSC的代表性形态（第1天，第7天）。比例尺=50μm

食谱

含有10％FBS和抗生素的α-MEM α-MEM 445ml
FBS 50ml
100x抗生素 - 抗真菌5ml ml
胶原酶溶液3mg/ml（用于来自两膝关节的滑膜）
α-MEM 3ml
胶原酶V 9mg

致谢

我们没有利益冲突准备这篇文章。这项研究得到了日本医学研究开发机构（AMED）到IS的再生医学实现高速公路项目的支持。

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