材料和试剂

15ml Falcon管（VWR International，目录号：734-0452）
2ml Eppendorf安全锁管（VWR International，目录号：211-2165）
2ml螺旋盖管（VWR International，目录号：211-0093）
具有插入物的色谱小瓶（VWR International，目录号：548-0120）
用于色谱小瓶（VWR International，目录号：548-1151）的快速盖子
手动移液器提示
拟南芥种子
2-脱氧-D-葡萄糖（2-脱氧-Glc）（Sigma-Aldrich，目录号：D6134-1G）
D - （ - ） - 核糖（Rib）（Sigma-Aldrich，目录号：R7500-5G）
L - （+） - 阿拉伯糖（Ara）（Sigma-Aldrich，目录号：A3256-25G）
L - （ - ） - 岩藻糖（Fuc）（Sigma-Aldrich，目录号：F2252-5G）
D - （+） - 半乳糖（Gal）（Sigma-Aldrich，目录号：G0750-25G）
D - （+） - 半乳糖醛酸一水合物（GalA）（Sigma-Aldrich，目录号：48280-5G-F）
D - （+） - 葡萄糖（Glc）（Sigma-Aldrich，目录号：G8270-100G）
D-葡萄糖醛酸（GlcA）（Sigma-Aldrich，目录号：G5269-10G）
D - （+） - 甘露糖（Man）（Sigma-Aldrich，目录号：M8574-25G）
L-鼠李糖一水合物（Rha）（Sigma-Aldrich，目录号：R3875-5G）
D - （+） - 木糖（Xyl）（Sigma-Aldrich，目录号：X3877-25G）
超纯水（25℃时为18.2MΩ·cm）
氢氧化钠（NaOH）（VWR International，目录号：BAKR3727.2500）
三氟乙酸（TFA）（Carl Roth GmbH + Co.，目录号：6957.1）
糖标准储备（见配方）
9糖混合（见配方）
2 M TFA（参见配方）
10 mM NaOH（参见配方）
733mM NaOH（参见配方）

设备

高压灭菌器
水净化系统（Milli-Q或类似风格）
手动移液器（Eppendorf AG，Research plus和Repeater Plus样式）
分析天平（Mettler-Toledo，型号：XSE205DU）
球磨机（Retsch GmbH，目录号：MM400）
两个用于球磨机的24个TissueLyser适配器（QIAGEN，目录号：69982）
实验室外套
安全眼镜
耐化学性手套（Honeywell，Dermatril，目录号：740或类似风格）
通风橱
样品浓缩器（Bibby Scientific Limited，Techne，目录号：FSC400D），配备
1. 127mm针（Bibby Scientific Limited，Techne，目录号：F7210）
2. 驱动块加热器（Bibby Scientific Limited，Techne，目录号：DB200/3）
3. 三个铝块（Bibby Scientific Limited，Techne，目录号：F3505）
4. 连接到中央气源，在通风橱
制冰机
离子色谱（IC）：配有Dionex DX-600系统
1. AS50自动进样器
2. GP50梯度泵
3. ED50电化学检测器
4. CarboPac PA20保护柱（Thermo Fisher Scientific，Dionex Softron，目录号：060144）
5. CarboPac PA20分析柱（Thermo Fisher Scientific，Dionex Softron，目录号：60142）
涡流混合器（Scientific Industries Inc.，型号：Vortex-Genie 2或类似型）
台式离心机（与2 ml管相容）
带有用于2ml管的盖的架（VWR International，目录号：211-0215）
血清移液管（Thermo Fisher Scientific，Nunc型或类似样式）
2升容量瓶
氦气罐

软件

Chromeleon 6.8色谱数据系统软件（Thermo Fisher Scientific，Dionex）
具有真实统计资源包的Microsoft Excel（ http://www.real-statistics.com/ ）

程序

植物生长，种子收获和存储
由于粘液表型受到种子如何产生，收获和储存的影响（参见最近的综述，Voiniciuc等人，2015c），因此必须分析在相同条件下生长的种子。我推荐Voiniciuc和Günl（2016）描述的程序，其在多代中产生一致的种子质量和粘液化学型（Voiniciuc等人，2015a; Voiniciuc等人，，2015b; Voiniciuc 等人，2015c）

非粘连胶浆的提取

对于每个实验（最多48个样本），请准备包含相关字段的电子表格（例如样品＃;种子重量;种子袋;基因型）。为了简化标记，请为每个样本指定两位数字（例如 01至48）。
注意：每个样品将执行两次连续提取。
使用样品编号预先标记2 ml Safe Lock试管的侧面。使用分析天平为每个管添加4-6 mg种子，并在电子表格中记录精确重量。

通过将所示体积加到2ml螺旋盖管中来制备表1中列出的标准
表1.用于单糖定量的9-糖混合物（10 mg/ml）的稀释系列

标签	S000	S001	S002	S005	S010	S025	S050	S075	S100	S125
微博	0	1	2	5	10	25	50	75	100	125
μg	0	1	2	5	10	25	50	75	100	125

准备足够的30微克/毫升Rib（内部标准＃1）解决方案，在一个实验中添加1毫升到所有样品和糖标准。对于具有48个样品和10个标准品的典型实验，加入180μl的10mg/ml肋，并用超纯水填充至60ml。
使用中继移液器，向所有样品和标准品中加入1ml内标＃1
用样品管手动倒置样品架，将所有种子悬浮在溶液中。将样品水平放置在一个盒子（足够大，有单层管）。在室温（〜24℃）下使用轨道振荡器在200rpm下摇动30分钟注意：这种处理只从种子上剥离非粘性胶浆（图1B）。。

图1.在RR中直接染色的野生型（Col-0）种子，没有振荡（A），或在非粘附物（B）之后，）和粘附（C）连续提取。条= 0.4mm
让种子沉淀至少30秒。对于每个样品，将800μl上清液转移到2ml预先用字母N标记的螺旋帽管（用于非粘附胶浆提取）随后是样品编号。
注意：请勿转移任何种子，并且不要在这一点上盖住管。
使用样品浓缩器在45℃的气流下蒸发非粘附的粘液样品和标准品。
用1ml水洗涤2ml Safe Lock试管中的种子，弃去溶液注意：请确保不删除种子。
重复步骤B9一次。尽可能多地去除剩余的水，而不损失种子。
注意：如果有第二个样品浓缩器，那么可以立即将种子用于粘附粘性提取。或者，将冲洗的种子储存在-20℃，并在开始第二次提取之前完成非粘附胶浆样品的分析（干燥，水解和最终洗脱）。

提取粘附胶浆
1. 通过添加表1中列出的体积，在2 ml螺旋盖管中制备一套新的10个标准品用于粘附胶浆定量。
2. 准备足够的30μg/ml 2-脱氧-Glc溶液（内标＃2），以添加1毫升到所有样品和糖标准。
3. 使用中继器移液管，添加1毫升内标＃2到新的标准，并在安全锁管中（从非粘附胶浆提取;完全解冻，如果以前冷冻）冲洗的种子。
4. 通过基本上进行全部粘液提取去除粘附的粘液（Voiniciuc和Günl，2016）。在室温（〜24℃）下，在球磨机中使用两个24个TissueLyser适配器在30Hz下将含种子管摇动15分钟。
5. 当种子振动时，用信号A（用于粘附胶浆提取），随后为每个样品编号预先标记2ml螺旋盖管的侧面。
6. 旋转块180°，并在30 Hz下再振动15分钟，以完成粘液提取。
  注意：这会从种子上剥离所有的粘性胶浆（图1C）。
7. 让种子沉淀至少30秒。对于每个样品，将800μl上清液转移到相应的2ml螺旋帽管（在步骤C5中预先标记）。
  注意：不要转移任何种子，此时不要将瓶盖拧在管子上。
8. 使用样品浓缩器在45℃的空气流下干燥粘附的粘液样品和新标准品。从这一点向前处理样品和标准相同。
基质多糖水解
注意：相同的步骤用于制备两种粘液提取物。如果Techne Dri-blocks中有足够的空间用于所有样品和标准，则只能平行水解两种提取物。
1. 使用中继器移液管，加入300μl的2M TFA到所有管。
2. 紧紧盖上每个管，并涡旋3秒。
3. 将管转移到Techne Dri块（预热至120℃）并孵育60分钟
4. 凉快的加热块和管在冰。以最高速度离心管30秒。
5. 盖帽管，并在45℃的空气流下使用样品浓缩器蒸发TFA。
  注意：请以正确的顺序将盖子放在干净的纸巾上。
样品的最终洗脱
1. 加入600微升的高压灭菌，超纯水的所有管使用中继移液器。涡旋混合3秒。
  注意：如果使用中振动强度和小心，管不需要加盖此步骤，因为解决方案不会溢出。
2. 转移150μl从每个管到带有插入物的预标记的IC小瓶。用盖子密封小瓶。
3. 以升序将管置于Dionex DX-600系统的自动进样器中，但将样品和标准品的注射顺序随机（例如使用Microsoft Excel）。
单糖的分离和定量
1. 基本上如Voiniciuc和Günl（2016）所述，使用CarboPac PA20 Guard和分析柱在40℃和0.4ml/min的恒定流速下进行基于脉冲安培检测（HPAEC-PAD）的高效阴离子交换层析，。
2. 确保足够体积的三种洗脱液（超纯水，10mM NaOH和733mM NaOH）可用于运行所有的样品和标准用于两种粘液提取。
3. 用2mM NaOH（80％水，20％10mM NaOH）平衡柱10分钟
4. 注入10μl每个样品。
5. 用2mM NaOH（80％水，20％10mM NaOH）在18分钟内分离中性糖
6. 泵513mM NaOH（70％733mM NaOH，30％水）7.5分钟以分离糖醛酸
7. 最后，用733mM NaOH冲洗该柱4分钟。
  注意：对于每个样品和标准，重复步骤F3-7中的方法。
8. 如Voiniciuc和Günl（2016）所述，通过配置Chromeleon色谱数据系统软件（Dionex）中的峰表和检测参数自动注释单糖峰。
  注意：需要进行少量调整以注释2-脱氧-Glc的峰（保留时间为2.5至3.0分钟），并将其设定为粘附的粘液样品和相应标准品的内标。
9. 检查Chromeleon中的色谱图，以确保所有峰都正确标记。
  注意：如有必要，请手动更正任何错误标记的峰。
10. 在每次提取中，将所有单糖量标准化为内标，并基于标准稀释系列的校准曲线以μg表示（表1）。
  注意：在粘附的粘液样品中仅检测到痕量的Rib，表明两次水洗有效地去除了非粘附的粘液溶液的携带。因此，30μgRib可以安全地用作粘附胶浆提取物的内标，无需调整2-脱氧-Glc的检测参数。
11. 将每个样品中的单糖数量（以μg表示）导出到Microsoft Excel中进行最终计算
最终计算和统计分析
在连续提取物中检测到的单糖的量可以表示为绝对水平（图2A），或者表示为每种糖与种子的相对脱离（图2B）。

图2.基于连续提取的粘液脱离的定量 A.非粘附和粘附提取物中的粘液糖的绝对量。 B.单独的粘液糖或它们的组合总和的脱离，表示为在两个连续提取物中检测到的总量的百分比。图表显示先前分析的野生型（Col-0）种子的五个生物学重复的平均值±SD（Voiniciuc等人，2015b）。
1. 糖量（以μg表示）可除以用于每次粘液提取的种子量（以mg表示），以计算绝对组成（μg糖/mg种子）。
  注意：对于非粘附和粘附提取单独执行此计算。
2. 绝对单糖水平也可以表示为相对于所用种子的量标准化的分子数。为了计算每mg种子的nmol糖，将步骤G1中获得的值除以相应糖的分子量（表2），并将结果乘以1000。
  注意：对每个提取单独执行此计算（图2A）。
  
  表2.最终计算的单糖的摩尔质量
  
  糖
  Fuc
  Rha
  Ara
  Gal
  Glc
  Xyl
  男士
  GalA
  GlcA
  
  质量
  164.16
  164.16
  150.13
  180.16
  180.16
  150.13
  180.16
  194.14
  194.14
3. 每种粘液成分的相对脱离（以百分比表示）等于其非粘附量除以非粘附部分和粘附部分中的特定单体的总和。种子粘液的整体脱离是非附着糖与顺序提取的糖总量（基于步骤G1中计算的值）的比率。
4. 比较野生型和突变体的粘液脱离的统计分析可以在Excel中进行。可以使用Excel内置的T.TEST函数比较具有多个生物学复制的两种基因型之间的粘液级分中特定单糖的绝对量或其与种子的相对脱离。当许多突变体（及其各种糖组分）与野生型比较时，可以使用条件格式化（例如突出显示具有 P - 值<0.05的细胞）揭示哪些组件被显着改变。双因素方差分析（ANOVA）也可以在Excel中使用真实统计资源包（ http：//www.real-statistics.com/），以评估两个独立突变（通过野生型，单个和双重突变体样品的分析）如何影响粘液分离。
  注意：在几种细胞壁突变体中，影响具有不同功能的基因，约90％的Rha和GalA分子（粘液中最丰富的糖）是非粘附的（Voiniciuc等人，2015a）。尽管不同基因的损失导致了粘液脱离的类似增加，但是将粘液锚定到种子表面的精确机制仍有待阐明。

食谱

糖标准品（10 mg/ml）
对于除GalA和Rha之外的每种单糖，通过将100mg糖溶解在10ml无菌15ml Falcon管中的经高压灭菌的超纯水中来制备单独的原液。
由于它们以一水合物形式出售，使用109mg GalA和111mg Rha而不是标准100mg。
将2-脱氧-Glc和Rib储液分装到2ml Safe Lock试管中，因为它们经常使用。
将所有原液储存在-20°C。
9-糖混合物（1mg/ml）
对于10ml溶液，将1ml水与1ml Fuc，Rha，Ara，Gal，Glc，Xyl，Man，GalA和GlcA（全部10mg/ml储液）混合。
将9-Sugar混合物分装到2ml Safe Lock试管中，并储存在-20℃
2 M三氟乙酸（TFA）通过向423ml超纯水中缓慢加入77ml TFA（12.98M）制备500ml 2M TFA溶液。
注意：在通风橱中使用适当的个人防护装备进行TFA。
10mM NaOH（IC洗脱液）
使用容量瓶将2 L超纯水转移到适当的洗脱液容器
使用1ml血清移液管加入1040μl50％（w/v）NaOH 使用氦气脱气洗脱液5分钟
733mM NaOH（IC洗脱液）
使用容量瓶将2 L超纯水转移到适当的洗脱液容器
使用50ml血清移液管加入总共80ml的50％（w/v）NaOH 使用氦气脱气洗脱液5分钟

致谢

所提出的顺序提取方法来自（Voiniciuc等人，2015b），并且也简要地描述（Voiniciuc等人，2015a）。这项工作扩展了Voiniciuc和Günl（2016）的协议，并得到加拿大自然科学和工程研究委员会（PGS-D3授予C.V.）的支持。

参考文献

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Macquet，A.，Ralet，M.C.，Kronenberger，J.，Marion-Poll，A.and North，H.M。（2007）。原位，化学和大分子研究的组成 Arabidopsis thaliana seed coat mucilage 。植物细胞生理学48（7）：984-999。
Voiniciuc，C。和Günl，M.（2016）。可从拟南芥种子提取的总粘液中的单糖分析生物协议 6（9）：e1801。
Voiniciuc，C.，Gunl，M.，Schmidt，M. H.和Usadel，B。（2015a）。由IRREGULAR XYLEM14和MUCILAGE-RELATED21制造的高支化木聚糖将粘液连接至拟南芥 >种子。植物生理学 169（4）：2481-2495。
Voiniciuc，C.，Schmidt，M. H.，Berger，A.，Yang，B.，Ebert，B.，Scheller，H. V.，North，H. M.，Usadel，B.and Gunl， MUCILAGE-RELATED10可产生在拟南芥种子中保持果胶和纤维素结构的半乳葡甘露聚糖粘液。植物生理学 169（1）：403-420
Voiniciuc，C.，Yang，B.，Schmidt，M. H.，Gunl，M。和Usadel，B.（2015c）。开始凝胶：如何拟南芥种皮表皮细胞产生特化的继发细胞。Int J Mol Sci 16（2）：3452-3473。